钙离子、铝离子及过氧化氢处理对洋葱内表皮细胞骨架影响的初步研究

冯振月，刘德福，崔玉东

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319，2.黑龙江省农科院大庆分院）

钙离子、铝离子及过氧化氢处理对洋葱内表皮细胞骨架影响的初步研究

冯振月1，刘德福2，崔玉东1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319，2.黑龙江省农科院大庆分院）

为了解植物细胞骨架在离子应激及氧化损伤时细胞骨架变化情况，以洋葱为实验材料，使用0.05、0.1、0.15 mol·L-1CaCl2处理洋葱内表皮细胞 2 h；0.01、0.025、0.05 mol·L-1AlCl3处理 10 min；0.01、0.025、0.05 mol·L-1H2O2处理 2 h，观察这三种因素处理后洋葱细胞骨架变化情况。结果表明：随着钙离子浓度的升高，洋葱内表皮细胞的细胞质骨架解聚，细胞核消失；铝离子浓度越高，细胞质骨架越少，受损越严重，并出现边极化现象；随过氧化氢浓度升高，细胞骨架解聚，低浓度的过氧化氢即可造成细胞骨架破坏。

钙离子；铝离子；过氧化氢；洋葱内表皮细胞；细胞骨架

细胞骨架（cell skeleton）是指真核细胞中的蛋白质纤维网架体系，包括微管、微丝和中间丝等[1]。分为细胞质骨架和细胞核骨架两大类[2]。细胞骨架不仅在维持细胞形态和细胞内部结构的有序性中起着重要作用，还与物质输运、细胞运动、信息传递、能量转化、细胞分裂和分化、细胞的凋亡和癌变等生命活动相互联系[3-5]。植物的许多生理过程如极性生长、叶绿体运动、保卫细胞分化、卷须弯曲等都有细胞骨架的参与[6]。

细胞骨架的骨架纤维结构是由不同的蛋白质亚单位以特定的方式聚合形成的。三种细胞骨架成分在细胞内始终处于动态装配状态，正是因为这种独特的蛋白质组成和结构特点，决定了它对外界的离子作用异常敏感，而且细胞骨架有其特有的理化性质，一些能使蛋白质变性的化学试剂（如秋水仙素、SDS）及物理因素如离子浓度、pH值、温度、紫外线和微重力等都可以使其发生变化。

以洋葱为实验材料，从形态上对洋葱内皮细胞骨架在不同的离子浓度应激下对细胞骨架的影响进行了研究，并对这些影响因素进行了分析，从形态学上分析不同离子条件下细胞骨架的变化，主要意义在于评估植物生长过程中，施肥和环境污染中的离子对其骨架的影响。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

新鲜洋葱鳞茎内表皮

1.2 试验试剂

M 缓冲液；1%Triton X-100，3% 戊二醛，0.2%考马斯亮蓝 R250 染液，0.01 mol·L-1PBS（pH 6.8）；氯化钙；氯化铝；过氧化氢[7]。

1.3 试验方法

1.3.1 钙离子处理

处理：以PBS做对照，分别加入 0.05、0.1、0.15 mol·L-1CaCl2溶液处理洋葱鳞茎内表皮2 h；抽提：吸去PBS或CaCl2溶液，加1%Triton X-100去垢剂溶液2 mL，使液体充分浸泡材料，室温中处理25 min，M-缓冲液洗三次，每次5 min；固定：3%戊二醛固定30 min，倒去戊二醛，PBS洗三次，每次5 min；染色：吸去PBS缓冲液，滴几滴0.2%考马斯亮兰R250染料，染色1 h；观察：多功能显微镜20～400倍镜下拍摄细胞骨架照片，用以分析。

1.3.2 铝离子处理

（1）将AlCl3取代PBS做前期处理（以PBS做对照）：将洋葱鳞茎内表皮分别置于0.001 mol·L-1AlCl3，0.002 mol·L-1AlCl3，0.004 mol·L-1AlCl3溶液中浸泡10 min。

（2）抽提与观察同1.3.1钙离子处理。

1.3.3 过氧化氢（H2O2）处理

将H2O2取代PBS做前期处理（以PBS做对照）：将洋葱鳞茎内表皮分别置于0.01、0.02、0.04 mol·L-1H2O2处理2 h。抽提与观察同1.3.1钙离子处理。

2 结果与分析

2.1 Ca2+对洋葱细胞骨架的影响

对照组经PBS溶液处理的洋葱内表皮细胞骨架保持一种聚合状态且大量的分布在细胞核周围，骨架排列紧密（图1A）；不同浓度的CaCl2溶液处理2 h后细胞骨架变化明显：0.05 mol·L-1CaCl2处理洋葱内表皮细胞骨架与对照组无明显差异（图1B）；0.1 mol·L-1CaCl2处理的洋葱细胞细胞核趋边且大部分由圆形变为不规则形状（图 1C）；0.15 mol·L-1CaCl2浓度处理的细胞核骨架解聚消失（图1D）；由此可见，0.05 mol·L-1CaCl2溶液处理的洋葱鳞茎内表皮几乎不影响细胞骨架，而0.1 mol·L-1以上浓度CaCl2会影响细胞骨架，且浓度越高细胞骨架变化越明显，特别是对细胞核骨架影响较大。

图1 CaCl2处理对洋葱鳞茎内表皮细胞的影响Fig.1 The effect of CaCl2on inner-epidermal cells of onion

2.2 Al3+对洋葱细胞骨架的影响

分 别 以 PBS，0.001、0.002、0.004 mol·L-1AlCl3溶液处理洋葱鳞茎内表皮细胞10 min，与PBS对照组相比：0.01 mol·L-1AlCl3浓度处理的洋葱鳞茎内表皮细胞质骨架与对照（图2A）相比出现大量空泡，细胞核骨架趋边及变形且部分细胞核消失（图2B）；0.02 mol·L-1AlCl3处理的细胞质骨架聚缩且与0.01 mol·L-1AlCl3相比更多的细胞核消失（图2C）；0.04 mol·L-1AlCl3浓度处理的细胞质骨架剧烈聚集，几乎全部的细胞核消失，细胞质骨架大量解聚，没有解聚的骨架也聚缩到细胞中央完全脱离了细胞膜（图2D）；由此可见，AlCl3溶液处理的洋葱鳞茎内表皮仅10 min对细胞质骨架有明显影响，且对细胞质骨架和细胞核骨架影响都较大。

图2 不同浓度AlCl3处理对洋葱鳞茎内表皮细胞的影响Fig.2 The effect of AlCl3on inner-epidermal cells of onion

2.3 过氧化氢对细胞骨架的影响

分别以 PBS，0.01、0.02、0.04 mol·L-1H2O2处理洋葱鳞茎内表皮2 h，与PBS对照相比，0.01 mol·L-1H2O2处理2 h后细胞核骨架分裂成几个颗粒状（图3B）；0.02 mol·L-1H2O2浓度处理 2 h 的细胞质骨架边缘部分解聚，造成与细胞膜的连接断开（图3C）；0.04 mol·L-1H2O2浓度处理2 h的细胞质骨架解聚并聚集到细胞中央（图3D）。由此可见，H2O2溶液在低浓度时对细胞核骨架影响剧烈，在高浓度下对细胞质骨架影响大。

图3 不同浓度H2O2处理对洋葱鳞茎内表皮细胞的影响Fig.3 The effect of H2O2on inner-epidermal cells of onion

3 讨论

细胞骨架是细胞内弹性框架结构，对维持细胞结构的稳定、保持细胞完整性及细胞功能的完善有着重大的意义，而细胞骨架本身容易受外界因素影响而发生变化的，如化学因素、物理因素都有可能会造成骨架蛋白的变性[7]。

细胞质骨架主要由微管和微丝和中间丝组成，其中微管骨架是由微管蛋白和微管多种相关蛋白组成，它通过其解聚和聚合的动态变化完成对细胞生命活动的调节。微管执行其正常的功能需要有一个精密有效的骨架调节系统。大量的研究结果表明，充当第二信使的Ca2+在其中发挥了作用[8]。微管解聚正常速率为每个微管末端100～400个每秒不等，当Ca2+浓度大于1 mmol·L-1时，其解聚速率可增加10倍[9]。在猪脑提取物中，1 μmmol·L-1的 Ca2+即可以激发ATP 加速微管的聚合，而高浓度（10 mol·L-1）则抑制其聚合。这表明在体外Ca2+通过其浓度的变化对微管骨架进行装配水平的调节[10]。

试验虽然没有深入研究Ca2+对微管影响的分子机制，但从形态学的结果可以看到Ca2+对细胞骨架影响严重：0.01 mol·L-1AlCl3处理洋葱细胞与PBS相比很多细胞核消失（图2C）；0.04 mol·L-1AlCl3浓度处理，几乎全部的细胞核消失，细胞质骨架剧烈聚集，没有解聚的骨架聚缩到细胞中央完全脱离了细胞膜。

植物细胞骨架可能是铝毒害的细胞作用部位Ryan、Sasaki[10，11]。铝毒害有短期反应（铝处理几分钟，甚至几秒钟即可发生）和长期反应。铝可通过直接作用于细胞骨架的元素或间接通过钙信号系统来改变细胞骨架系统[8]。Macdonald等研究表明[13]，在细胞体外Al3+强烈促进微管蛋白亚基聚合形成微管，Grabski和Schindler也报道，Al3+会诱导大豆根悬浮细胞肌动蛋白网硬化[14]。但有研究却表明，铝胁迫会导致微管和微丝的解聚。Blancaflor等发现[15]，3 h的铝处理就会诱导根的伸长区微管僵硬性的增加。试验从形态学上表明Al3+确实可以在短时间内，低浓度下对洋葱鳞茎内表皮细胞骨架造成剧烈影响。

H2O2很容易通过细胞进入细胞中，外源性H2O2作用引起细胞内Ros升高从而引起细胞骨架变化[16]。实验中，H2O2在低浓度时对细胞核骨架影响剧烈，在高浓度下对细胞质骨架影响大0.01 mol·L-1H2O2处理24 h后。细胞发生聚集、边缘化和区域化。实验通过Ca2+，Al3+，H2O2对洋葱细胞骨架的影响进行了形态学初步的研究，使我们对离子应激条件下植物细胞骨架的形态学变化有一个初步的了解，为进一步对不同应激环境对细胞骨架影响的分子机制研究打下了一定的基础。

［1］ 翟中和.细胞生物学实验［M］北京.高等教育出版社，2011.

［2］ 张永伟，刘卓，左瑾，等.细胞骨架与血糖调节［J］.生命科学，2005，17（2）：159-164.

［3］ 高清，吴波.细胞凋亡与细胞骨架的改变［J］.医学研究生学报，2008，21（8）：877-900.

［4］ Espindola F S，Suter D M，Partata L B，et a1.The light chain composition of chicken brain myosin Va：calmodulin，my osin-II essential light chains，and 8-kDa dynein light chain［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2000，47（4）：269-281.

［5］ 王健楠，阮洪生.身痛逐瘀汤通过调控P38 MAPK信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮的分泌［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（3）：75-78.

［6］ 王忠.植物生理学［M］.北京：中国农业出版社，2010.

［7］ 马云，张妍妍，王启钊，等.不同处理条件对洋葱鳞茎表皮细胞骨架形态影响的研究［J］.茂名学院学报，2009，19（3）：15-19.

［8］ 刘刚，王冬梅.细胞信号转导中Ca2+和微管骨架的关系［J］.植物生理学通讯，2006，42（2）：331-336.

［9］ Gal V，Martin S，Bayley P.Fast disassembly of microtubules induced by Mg2+or Ca2+［J］.Biochem Biophys Res Commun，1988，155（3）：1464-1470.

［10］ 刘义，吴育廉，邓亦峰，等.半边旗提取物5F体外对猪脑微管蛋白聚合的影响［J］.中国药理学通报，2005，21（4）：447-449.

［11］ Ryan PR，Tomaso JM，Kochian LV.Aluminum toxicity in roots：an nvestigation of spatial sensitivity and the role of the root［J］.Cap.J.Exp.Bot.，1993，44：437-446.

［12］ Sasaki M，Yamamoto JM，Matsumoto H．Lignin deposition induced by aluminum in wheat（Triticum aestivum）roots［J］.Soil Sci.Plant Nutr，1996，43：469-472.

［13］ Macdonald TL，Humphreys WG.Martin RB.Promotion of tubulin assembly by aluminum ion in vitro［J］.Science，1987，236：183-186.

［14］ Grabski S ，Schindler M.Aluminum induces rigor within the actin network of soybean cells ［J］.Plant Physiol，1995，108：897-901.

［15］ Blancaflor EB，Jones DL，Gilroy S.Alteration in the cytoskeleton accompany aluminum-induced growth inhibition and morphological changes in primary roots ofmaize［J］.PlantPhysi，1998，118：159-172.

［16］ 袁小丽.ROS对仔猪支持细胞骨架的影响及机制研究［D］.重庆：西南大学，2008.

Preliminary Study On the Influence of Ca2+，Al3+and H2O2Treatments for Cytoskeleton from Onion Inner-epidermal Cell

Feng Zhenyue1，Liu Defu2，Cui Yudong1
（1.College of Llife Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences）

The onion was used as the experimental material to understand the change of the plant cytoskeleton in ion stress and ox idative damage.Theinner-epidermal cell of onion was treated with 0.05，0.1，0.15 mol·L-1CaCl2for 2 h，0.01，0.025，0.05 mol·L-1AlCl3for 10 min and 0.01，0.025，0.05 mol·L-1H2O2for 2 h，and then the cytoskeleton of onion was observed after treatment with these three factors.The results showed that with the increase of the concentration of calcium ion that the cytoplasm skeleton depolymerization and nucleus disappear，the higher the concentration of aluminum ions less cytoplasmic skeleton was observed and the more serious damage of cells，side polarization appeared.With the increase of the concentration of H2O2，Cytoskeleton was depolymerized in Cytoplasm and could cause the destruction of the cytoskeleton with low concentration of H2O2.

calcium;aluminum;H2O2;Onion epidermal cells;Cytoskeleton

Q245

A

1002-2090（2017）06-0024-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.007

2016-03-21

大肠杆菌ABC家族转运体yddA功能的初步研究（XZR2015-11）。

冯振月（1977-），女，讲师，西南大学毕业，现从事细胞生物学及大肠杆菌基因功能的理论与实验教学工作。

崔玉东，男，教授，博士研究生导师，E-mail：1016856109@qq.com。