肺痿论治干预肺纤维化大鼠肺功能的实验研究

康荻 李彧 朱曼 唐磊 申萌萌 常立国 黄春芳 王继峰 牛建昭 李亚东

摘要 目的：比较麦门冬汤和甘草干姜汤在肺纤维化阶段对大鼠模型肺功能的干预作用。方法：用博莱霉素造模14 d的SD大鼠，灌胃麦门冬汤（7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg）和甘草干姜汤组（3.75 g/kg、7.5 g/kg、15 g/kg），模型组和正常组大鼠灌胃等体积饮用水。中药灌胃14 d后检测用力肺活量（FVC）、肺动态顺应性（Cdyn）、0.4秒率（FEV0.4/FVC%）、呼氣峰值流速（PEF）、最大呼气中期流速（MMF）等指标，检测血气变化，称量脏器质量、计算脏器系数，HE染色观察肺组织病理。结果：麦门冬汤高剂量组能够降低模型动物肺脏质量、肺脏系数（P<0.05），提高肺顺应性、FVC和质量FVC（P<0.05）；甘草干姜汤高剂量能够改善肺顺应性和FVC（P<0.05）；甘草干姜汤中剂量能够改善质量FVC、降低0.4秒率（P<0.05），保护非纤维化区肺泡结构；甘草干姜汤能够提高肺纤维化大鼠的PO2和SO2（P<0.05）。结论：麦门冬汤和甘草干姜汤对博莱霉素所致肺纤维化大鼠肺脏功能均具有改善作用，前者主要是改善气道周围纤维化区的间质增生，后者主要是保护非纤维化区的肺泡结构和功能。

关键词 甘草干姜汤；麦门冬汤；质量FVC；血气分析；肺顺应性

Abstract Objective：To observe different effects of Maimendong Decotion and Gancao GanjiangDecotionin on pulmonary fibrosis rat in the stage of fibrotic phase.Methods：After 14 days of establishing rat model by intratracheal injection of bleomycin，Maimendong decotion（7.5 g/kg，15 g/kg，30 g/kg） and Gancao Ganjiang decotion（3.75 g/kg，7.5 g/kg，15 g/kg） were given by gavage once a day for 2 week.Meanwhile，the model group and the normal group were administered with distilled water of same quantity.After gavage of decotion for 14 days，the forced vital capacity （FVC），the indexes of lung dynamic compliance（Cdyn），the ratio of FEV 0.4 to forced vital capacity（FEV0.4/FVC%），peak expiratory flow rate （PEF），maximal mid-expiratory flow rate （MMF） and the blood gas changes were recorded，then the organ coefficients were calculated，lung tissue and airway pathologic changes were observed by HE staining.Results：Compared with the model group，the high dose group of Maimendong decotion reduced the lung weight and lung index significantly（P<0.05），and increased Cdyn，FVC and FVC/lung weight significantly（P<0.05）.The Cdyn and FVC of high dose group of Gancao Ganjiang decotion were higher than the model group（P<0.05）.The intermediate-dose Gancao Ganjiang decotion improved FVC/lung weight （P<0.05） and reduced the rate of FEV0.4/FVC% significantly （P<0.05） compared with the model group.Gancao Ganjiang decoction improved PO2 and SO2 significantly compared to model group（P<0.05）.Conclusion：Both Maimendong decotion and Gancao Ganjiang decotion are better for the rat model of bleomycin induced pulmonary fibrosis.The former can reduce the interstitial hyperplasia around the airway in fibrosis area，and the latter protect the structure and function of the alveolar in non-fibrosis area.

Key Words Gancao Ganjiang Decotion； Maimendong Decotion； FVC/lung weight； Blood gas analysis； Dynamic compliance

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.038

肺痿一词出自张仲景《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》，属于中医病名，结合历代医家论述及现代临床观察发现中医所论肺痿与肺纤维化疾病相关[1]，并有多位中医专家提出了从肺痿论治肺纤维化的思路[2-3]。《金匮》论治虚热肺痿，“止逆下气”用麦门冬汤；论治虚寒肺痿，温扶阳气用甘草干姜汤[4]。瓮恒[5]等通过临床观察发现麦门冬汤能够改善特发性肺纤维化患者的肺功能；陆国辉等[6]则发现甘草干姜汤能够减轻博莱霉素导致的大鼠模型肺纤维化程度，可见肺痿论治的2组中药方剂具有一定抗肺纤维化效果，但未见比较二者的生物药效机制。而临床肺纤维化患者病因病机纷繁复杂，证候辗转，博莱霉素所致肺纤维大鼠模型化进展明确、病理稳定[7]，是国际上使用最广泛的鼠类肺纤维化造模方法[8]。我们拟通过灌胃麦门冬汤和甘草干姜汤比较肺痿论治的2组方剂在该模型肺纤维化阶段的干预效果。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠54只，12～13周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（动物合格证号为11400700093856），动物许可证号为SCXK（京）2012-0001。

1.2 试剂 中药饮片由河北美威药业股份有限公司提供，注射用盐酸博莱霉素15 mg/瓶（日本化药株式会社产品，批号：650472）。

1.3 仪器 动物肺功能仪（北京贝兰博科技有限公司生产，AniRes 2005）；i-STAT200便携式血气分析仪及血气测试芯片EG3+（雅培，美国）；数字切片扫描仪（由日本滨松光子学株式会社生产，NanoZoomer-SQ）；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，AL204）。

1.4 方法

1.4.1 中药汤剂制备 麦门冬汤（麦冬42 g，甘草6 g，生晒参9 g，梗米10 g，半夏6 g，大枣20 g）和甘草干姜汤（炙甘草12 g，干姜6 g）按照人民卫生出版社《方剂学》第七版组方，均采用水煎提取2次，合并滤液浓缩至生药浓度麦门冬汤4 g/mL，甘草干姜汤2 g/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 模型制备与分组 在符合清洁级标准的实验室（温度22～25 ℃，湿度50%～70%）适应饲养2周后，随机分为8组：正常组、模型组、麦低组、麦中组、麦高组、甘低组、甘中组、甘高组。正常组不加任何干预，其他各组大鼠于14周龄进行气管内注射博莱霉素（5 mg/kg），建立肺纤维模型。造模后第14天麦低组、麦中组、麦高组分别按7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg的浓度灌胃麦门冬汤水煎液，甘低组、甘中组、甘高组分别按3.75 g/kg、7.5 g/kg、15 g/kg的浓度灌胃甘草干姜汤水煎液，模型组灌胃等量饮用水，连续给药14 d。

1.4.3 检测指标与方法

1.4.3.1 肺功能检测 按设备提供的实验技术指导调试仪器确认系统正常。1%戊巴比妥钠按（70 mg/kg）腹腔内注射进行麻醉。行气管切开术后插管，将插管与气管结扎固定，以仰卧位将大鼠置于体描箱内，启动呼吸机，设置呼吸比20∶10，呼吸频率75次/min。以压力控制方式（30 cmH2O）检测用力肺活量（FVC）、肺动态顺应性（Cdyn）、0.4秒率（FEV0.4/FVC%）、呼气峰值流速（PEF）、最大呼气中期流速（MMF）等功能指标。

1.4.3.2 脏器系数的计算 肺功能检测完成后，腹主动脉放血处死动物，取出肺脏，去除肺外支气管；取脾脏，剔除白色脂肪组织及系膜；取肾脏，剥除脏膜。电子天平称重，根据脏器系数计算公式：脏器系数=脏器质量（g）/动物体重（g）×100%。

1.4.3.3 病理观察 取左肺，4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，冠状面切片，行HE染色。用数字切片扫描仪获取切片图像进行肺组织病理观察。

1.4.3.4 血气分析 肺功能检测结束后迅速打开腹腔，腹主动脉取血0.5 mL进行血气分析。测定酸碱度（pH）、氧分压（PO2）、二氧化碳分压（PCO2）、氧饱和度（SO2）等。

1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析：計量资料用均数±标准差（±s）表示。符合正态分布的计量资料采用单因素ANOVA进行检验；对于不符合正态分布的计量资料，采用秩和检验。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脏器质量和脏器系数

气管内注射博莱霉素造成模型大鼠肺纤维化，模型组体重相对于正常组下降显著（P<0.05），由于气管内注射容易受麻醉状态和个体差异影响造成体重标准差较正常组增加；与模型组相比灌胃2种方剂体重比较，差异无统计学意义；模型组大鼠由于炎性反应和间质增生造成肺脏质量、肺脏系数增加显著（P<0.05），麦高组能够降低病变肺脏的质量和肺脏系数（P<0.05）。见表1。

2.2 气道阻力及肺顺应性

与正常组相比所有致纤维化组均出现呼气相气道阻力（Re）升高（P<0.05），结合这些致纤维化组相对正常组动态顺应性（Cydn）下降（P<0.05），提示病变可能由气道障碍和（或）肺间质增生导致气腔张力增加所致；其中麦高组和甘高组相对模型组Cydn显著升高（P<0.05）。见表2。

2.3 肺功能检测结果

模型组与正常组大鼠相比PEF和MMF均降低（P<0.05），提示存在气道阻碍；结合FVC比正常组显著降低（P<0.05），降幅超过80%（参考临床），而0.4秒率（FEV0.4/FVC%）升高（P<0.05），提示博莱霉素所致肺纤维为限制性伴阻塞性（或限闭性）肺功能障碍。麦高组能够提高模型动物FVC（P<0.05），甘中组则降低模型动物的0.4秒率（P<0.05），同时改善气道阻力（P<0.05）。见表3。

2.4 质量FVC

质量FVC是FVC/肺质量的比值，由图1可见博莱霉素能够引起模型组动物质量FVC显著下降，而灌胃麦门冬汤中、高剂量和甘草干姜汤中、高组剂量均能升高病变动物的质量FVC（P<0.05）。

2.5 血气分析

模型组动物腹主动脉血氧分压（PO2）和血氧饱和度（SO2）相对于正常组下降（P<0.05）。2种方剂各剂量组的血气结果差异无统计学意义，故将各组结果合并比较发现：相对于模型组，甘草干姜汤能够提高PO2和SO2（P<0.05），麦门冬汤只能单纯升高PO2，SO2差异无统计学意义。见表4。

2.6 病理观察

模型大鼠肺组织病理可分为纤维化区和非纤维化区，纤维化区由于肺泡被填充或间质增生塌陷，已丧失气体交换能力，因此考虑观察非纤维化区的肺泡结构来分析气血功能。正常组肺泡壁自然回弹，肺泡上皮细胞间距离缩短、排列整齐；毛细血管床丰富，可见红细胞分布。模型组可见肺泡间质内成纤维细胞增生，肥厚的肺泡壁回弹受阻，肺泡腔增大；毛细血管床受压、血流受阻，可见红细胞分布减少。麦中组肺间质也明显可见成纤维细胞填充，红细胞分布减少。甘中组肺间质较少受累于成纤维细胞，可见丰富的毛细血管床和大量红细胞分布。见图2。

3 讨论

质量FVC（FVC/肺质量单位）是课题组在实验中摸索的一个用于反应纤维化过程中肺组织结构与功能关系的指标。随着肺纤维化进展，肺脏质量增加，而FVC下降（受到增生的肺间质限制和或正常肺泡区域占比减少）。FVC/肺质量相对更加全面评价纤维化的病变程度，能够避免病理切片由于取材部位不均和个体差异的影响。从实验结果来看：质量FVC能够灵敏的反应出用药组与模型组间的差异，而单纯肺脏质量、肺脏系数以及肺功能的各项指标均未能灵敏地反映出用药组的变化。

李瑞琴[9]等曾探讨麦门冬汤对肺纤维化早期炎性反应的影响，杨美凤[10]等则研究了麦门冬汤对肺纤维化形成阶段的影响。本研究认为中医肺痿已远离早期炎性反应，多已进入肺纤维化进展阶段，故将给药时间窗调整到造模14 d开始，此时已进入纤维化期[7]。结果发现灌胃麦门冬汤高剂量能够改善病理，与杨美凤等[10]一致；此外还能够降低肺脏质量、肺脏系数，提示纤维化大鼠的炎性反应或ECM沉积得到改善；结合肺顺应性、FVC和质量FVC同时升高，明确高剂量麦门冬汤确实能够改善肺功能。但0.4秒率却未见好转，结合仍存在气道功能障碍以及病理可见博莱霉素所致肺纤维化为气道中心性病变，提示高剂量麦门冬汤对于肺功能的改善可能得益于对气道周围纤维化区的缓解。

甘草干姜汤高剂量对于肺功能的影响与灌胃麦门冬汤高剂量十分类似，但肺质量和肺脏系数未见改善，提示甘草干姜汤高剂量组对于肺功能的改善可能不在纤维化区，而是对非纤维化区肺泡功能的改善，中剂量组0.4秒率明显改善也进一步证明了这一点。病理结果可见甘草干姜汤中剂量组能够抑制正常肺泡区间质增生，保持肺泡正常结构，延缓纤维化进展。其分子机制可能与陆国辉等[6]报道甘草干姜汤能够下调TGF-β1、Smad3和SIRT1蛋白表达，并上调Smad7蛋白表达有关。血气分析结果则显示甘草干姜汤能够升高纤维化大鼠动脉血的PO2和SO2，也进一步证实甘草干姜汤能够改善肺泡的气体交换功能。孙成成等[11]报道1/10的肺纤维化住院患者使用了复方甘草，覃冬云等[12]发现甘草酸对血清和组胺诱发的大鼠气道平滑肌细胞的增生具有抑制作用；营大礼[13]报道干姜能够改善局部血液循环，进一步提示甘草干姜汤的药效作用可能在于保護和改善肺泡功能。

最新的肺纤维化诊断共识强调肺纤维化患者肺功能主要表现为限制性通气功能障碍、弥散量降低伴低氧血症或Ⅰ型呼吸衰竭[14]。而麦门冬汤和甘草干姜汤对于博莱霉素所致肺纤维化大鼠模型的肺功能均具有改善作用，前者主要是改善气道周围纤维化区的间质增生，后者主要是保护非纤维化区肺泡结构和改善气体交换功能，提示临床用药是否也存在相似机制，根据2组方剂的作用特点是可否通过交替服用改善肺纤维化患者肺功能值得思考。

参考文献

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