新喜树碱衍生物的核磁共振谱分析与结构鉴定

高旭东，赵晓博，胡 玥，火 婷，邵士俊, 师彦平

(中国科学院 兰州化学物理研究所，中国科学院 西北特色植物资源化学重点实验室/ 甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州 730000)

新喜树碱衍生物的核磁共振谱分析与结构鉴定

高旭东，赵晓博，胡 玥，火 婷，邵士俊, 师彦平

(中国科学院 兰州化学物理研究所，中国科学院 西北特色植物资源化学重点实验室/ 甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州 730000)

以20(S)-喜树碱(CPT)为起始原料，对其进行结构修饰，合成了一种新的喜树碱衍生物CPT-A.并利用1D(1H、13C和DEPT135)和2D(异核单量子相关谱和异核多碳相关谱)核磁共振(NMR)技术对该化合物进行了结构确定，详细归属了CPT-A1H和13C NMR谱的化学位移，喜树碱骨架的指认结果与文献报道基本一致，并发现喜树碱骨架6位碳与取代基苯环3’位碳的化学位移相同，谱峰完全重叠，这在13C谱中是不常见的. 研究结果可为喜树碱类天然产物的发现和结构鉴定提供NMR数据支持和方法指引.

喜树碱衍生物; CPT-A; 核磁共振; 谱图解析; 结构鉴定

喜树碱(camptothecin，CPT)是从我国特有的珙桐科植物喜树中分离得到的喹啉类生物碱,由Wall等[1]于1966年首次分离得到，其对恶性肿瘤具有良好的抑制作用. 但由于喜树碱对消化系统和泌尿系统有较强的毒副作用，使得人们对喜树碱的研究一度失去了兴趣[2]. 直到1985年，Hsiang等[3]发现了喜树碱是拓扑异构酶I(topoisomerase I，Topo I)的特异性抑制剂，该化合物才重新引起了研究者的重视. 喜树碱分子式为C20H16N2O4，分子量348.34，该分子为五环结构：AB环为喹啉环，C环为吡咯环，D环是一个共轭的吡啶酮环，E环为α-羟基内酯环，其中E环有一个不对称中心(20S构型). 构效关系研究发现，内酯环和羟基20S构型是喜树碱抗肿瘤活性的关键部位[4]. 喜树碱的主要缺点在于药物本身的毒性较大、水溶性差以及在人体血浆中内酯环开裂导致的失活[5]. 因此，对其结构进行修饰，获得高效低毒的喜树碱衍生物显得尤为重要. 目前的研究主要集中在A、B和E 环的修饰上，其中7、9、10 和20 位碳是研究最多的修饰位点[6]. 现代波谱仪器如超导核磁共振波谱仪对新型喜树碱衍生物的结构进行精准表征是提供开发喜树碱类药物的有效手段.

核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)现象是磁矩不为零的原子核在外磁场的作用下，自旋能级发生塞曼裂分，共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程[7]. 塞曼裂分的大小与分子结构有着密切的关系，处于不同环境的同一种自旋核会产生不同的NMR谱，因而能够提供有关分子结构的信息. 自从20世纪70年代以来，核磁共振技术在有机化合物结构鉴定中发挥着极其重要的作用. 核磁共振可提供1D、2D以及3D数据，反映出大量的结构信息. 对于解析结构复杂的化合物，2D NMR技术具有简单、高效和可靠的特点[8]. 异核单量子相关谱( heteronuclear singular quantum correlation，HSQC)可以提供一键相关的碳氢信息，对于解析甲基、亚甲基和次甲基的氢碳是非常有帮助的. 异核多碳相关谱(heteronuclear multiple bond correlation，HMBC)将1H核和远程耦合的13C核关联起来，HMBC提供的是相隔2个和3个键的碳氢之间的相关信息，对于解析季碳原子以及被杂原子隔开的碳原子与氢原子之间的相关非常有利.

本文以20(S)-喜树碱为起始原料，对喜树碱的20位碳进行结构修饰，得到一个新的喜树碱衍生物CPT-A，并利用1D(1H、13C和无畸变极化转移,distortionless enhancement by polarization transfer, DEPT135)和2D(HSQC和HMBC)NMR技术对其进行结构鉴定，对CPT-A的1H和13C谱进行了详细的指认归属，喜树碱骨架的指认结果与文献报道基本一致. 在谱图解析中发现，喜树碱骨架6位碳与取代基苯环3’位碳的化学位移相同，谱峰完全重叠，这在13C谱中是不常见的[9]. 本工作为喜树碱类天然产物的发现和结构鉴定提供了NMR数据支持和方法指引.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AVANCE III HD 400 MHz超导核磁共振谱仪(Bruker Daltonics Inc.)；Bruker MicrOTOF-Q II高分辨飞行时间质谱(Bruker Daltonics Inc.)；DMSO-d6(D，99.9%)：美国CIL(Cambridge Isotope Laboratories, Inc)公司；喜树碱样品(98%) ：成都元成生物科技有限公司; 甲氨基吡啶(98%)：上海麦克林生化科技有限公司；三光气(98%)：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；苯酚(98%)：武汉易泰科技有限公司上海分公司.

1.2 仪器条件

1.2.1 核磁条件

喜树碱衍生物CPT-A在Bruker AVANCE III HD 400 MHz超导核磁共振谱仪上进行测试，溶剂为DMSO-d6，四甲基硅烷(tetramethylsilane, TMS)为内标，其余测试条件如表1所列.

1.2.2 质谱条件

离子源温度：180 ℃；离子源：ESI源；离子模式：正离子；碰撞能量: 8.0 eV；碰撞电压: 300 Vpp.

1.3 样品制备方法

取喜树碱样品(200 mg，0.57 mmol)于干燥的圆底烧瓶内，加入10 mL干燥的二氯甲烷，搅拌下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，211 mg，1.73 mmol)，室温搅拌5 min后，冰浴条件下加入三光气(57 mg，0.19 mmol)，在冰浴下反应2 h后，加入苯酚(64 mg，0.68 mmol)，反应在室温搅拌下过夜后停止反应. 经过滤，收集滤液，减压浓缩后用乙酸乙酯溶解，依次用水和饱和食盐水洗涤3次，收集有机相，无水硫酸镁干燥. 粗产品用硅胶柱色谱分离纯化得淡黄色粉末(229 mg，产率89%).

2 结果与讨论

2.1 CPT-A的结构确定

参照文献方法[10]，对天然产物喜树碱的结构进行修饰，合成了一种新的喜树碱衍生物CPT-A，结果如图1所示. 从1H和13C NMR谱(如图2、3所示)可以看出，与喜树碱的NMR谱图相比，新增加了苯环区氢和碳的峰，高分辨飞行时间质谱测得分子式为C27H20N2O6Na，计算值为[M + Na]+491.121 4，实测值为[M + Na]+491.121 0，通过上述试验结果，初步掌握了喜树碱衍生物CPT-A的结构.

表1 仪器主要参数Table1 MainparametersofNMR

图1 CPT-A的合成Fig.1 Synthesis of CPT-A

图2 CPT-A的1H NMR谱Fig.2 1H NMR spectra of CPT-A

图3 CPT-A的13C /DEPT135 NMR谱Fig.3 13C /DEPT135 NMR spectra of CPT-A

在此基础上，对喜树碱衍生物CPT-A进行了详细的NMR分析以及相应1H和13C化学位移的指认归属，其结果如表2所列. 表2中的原子编号如图1所示.

表2 CPT-A在DMSO-d6中的1H和13CNMR化学位移Table2 13Cand1HNMRdataofCPT-A (δinppm, JinHz) inDMSO-d6

2.2 CPT-A的1H NMR分析

图2为喜树碱衍生物CPT-A的1H NMR谱. 谱图中有13种不同的氢，从左到右，积分面积比为1∶1∶1∶1∶1∶2∶1∶1∶2∶2∶2∶2∶3，喜树碱衍生物CPT-A中共有20个氢，不同氢之间的比例代表了氢的个数. 从高场到低场，化学位移在δH0.96处的三重峰为18位甲基氢，δH2.26处的四重峰为19位亚甲基氢. 化学位移在δH5.29处的单峰和δH5.55处的四重峰分别为5位连氮的亚甲基氢和17位连氧的亚甲基氢. 17位亚甲基氢出现四重峰是因为17位碳在六元环上，两个质子是磁不等价质子，两个质子相互耦合. 对于芳香区的指认，最低场化学位移在δH8.70的7位单峰氢比较容易识别，δH7.22处的单峰为14位碳原子的氢. 此外，根据耦合裂分情况，化学位移在δH8.20和δH8.14的氢为12位或9位氢，δH7.88和δH7.73处的氢为11位或10位氢，这两组氢的详细归属需要结合二维HSQC和HMBC谱进行指认. 化学位移在δH7.20处的双峰、δH7.41处的dd峰和δH7.28处的三重峰分别为2’、3’和4’位的氢. 化学位移在δH2.50处的峰为DMSO溶剂峰，δH3.33处的峰为水峰，δH3.08处的峰为杂质峰.

2.3 CPT-A的13C/DEPT135 NMR分析

图3为喜树碱衍生物CPT-A的13C/DEPT135 NMR谱. 从13C谱中可以看出，共有24个碳峰，而化合物结构中总共有27个碳原子，说明有化学位移相同的碳原子重叠在一起. DEPT135表明，有1个甲基、3个亚甲基和9个次甲基，其余为季碳. 甲基和亚甲基很容易指认(如表1所列)，在δC121.2和δC130.3处有两个强度明显高于其他峰的碳原子，这很明显为衍生化结构中苯环上2’和3’位的碳原子. 其余次甲基的指认需要结合HSQC谱进行. 季碳原子中，化学位移在最低场δC167.4处的峰为21位酯基碳，δC156.9处的峰为16a位碳原子，化学位移在δC79.3处的峰为20位碳原子. 其余碳原子的指认需要结合HMBC谱进行.

2.4 CPT-A的HSQC分析

2D NMR技术(如HSQC和HMBC)对于解决1D NMR不能确定的氢和碳的化学位移以及谱峰重叠问题有明显的优势. 图4为喜树碱衍生物CPT-A的HSQC谱，利用HSQC谱图所提供的一键相关的碳氢信息，很容易指认尚未指认的一些氢和碳信息，如化学位移在δH7.22的14位氢原子所对应的14位碳原子(δC94.6)，化学位移在δH7.28处的4’位氢所对应的4’位碳原子(δC127.1)等. 从HSQC谱仍然无法确定12、9和10、11位氢的具体位置，暂且指认化学位移在δH8.20处的双峰为12位氢，则化学位移在δH8.14处的双峰为9位氢；指认δH7.73处的三重峰为10位氢，则δH7.88处的峰为11位氢. 这样通过HSQC谱也就暂时指认了9、10、11、12位碳原子的峰. 指认结果需要HMBC的进一步确认.

图4 CPT-ACPT-A的HSQC谱Fig.4 HSQC spectrum of CPT-ACPT-A

2.5 CPT-A的HMBC分析

通过以上HSQC谱初步指认了次甲基的碳原子，现在需要结合HMBC所提供的二键及三键相关的碳氢信息，归属季碳和尚未完全指认的其他氢碳的信息. 图5为喜树碱衍生物CPT-A的HMBC谱，从谱图中可以看出，化学位移在δC152.7处的碳与7、14和5位氢都有相关，这说明此处的峰为2位碳原子. 而化学位移在δC152.0处的峰与任何氢都没有相关，说明为衍生化结构中的a位碳原子. 以此类推，通过HMBC谱图，可以确定1’、3、15、16位季碳原子的位置. 对于碳原子的归属，只剩下6位碳原子以及与9、10、11、12位氢相关的8和13位碳原子. 13位碳的化学位移大于8位碳原子，所以化学位移在δC148.4的峰为13位碳原子，与它相关的氢为7、9、11、12位，10位氢不与13位碳原子相关，可以确定化学位移在δH7.73 处的三重峰为10位氢，δH7.88处的峰为11位氢. 从HMBC谱中还可以发现，化学位移在δC132.1处的7位碳与δH8.14处的氢有相关，说明此处的氢为9位氢，则δH8.20处的峰为12位氢. 化学位移在δC128.5处的季碳与7、12以及10位氢有相关，说明此碳为8位碳原子.

图5 CPT-A的HMBC谱Fig.5 HMBC spectrum of CPT-A

通过对1H、13C、DEPT135 NMR以及二维HSQC和HMBC的分析，归属了所有氢和碳的峰以及对应的化学位移. 但是在谱图中没有6位季碳的峰，在HMBC谱图中，化学位移在δC130.3处的3’位碳原子与5位氢原子有相关，观察13C和NMR谱图发现，3’碳原子峰高于2’碳原子，这些现象说明6位碳原子与3’位碳原子完全重合了，6位碳原子的化学位移(δC130.3)与文献值[11-12](δC130.74 /δC129.7)基本一致.

3 结论

本文对具有抗癌活性的天然产物喜树碱进行了结构修饰，合成了一种新的喜树碱衍生物CPT-A. 利用1H、13C、DEPT135 NMR以及二维HSQC和HMBC技术，对新喜树碱衍生物CPT-A进行了结构鉴定，并指认归属了1H和13C化学位移. 利用2D NMR技术，解决了喜树碱骨架6位碳与取代基团苯环3’位碳谱峰重叠的解析问题. 该工作为喜树碱类天然产物的发现和结构鉴定提供了NMR数据支持和方法指引.

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StructureIdentificationofNewCamptothecinDerivativesbyNuclearMagneticResonanceSpectrometry

GAO Xu-dong, ZHAO Xiao-bo,HU Yue, HUO Ting, SHAO Shi-jun, SHI Yan-ping*

(CASKeyLaboratoryofChemistryofNorthwesternPlantResourcesandKeyLaboratoryforNaturalMedicineofGansuProvince,LanzhouInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences(CAS),Lanzhou730000,China)

A new camptothecin(CPT) derivative CPT-A was synthesized by modifying camptothecin, one of the most important natural products. Its chemical structure was identified using 1D and 2D nuclear magnetic resonance(NMR) techniques. Both1H and13C chemical shifts of CPT-A were exactly assigned. The results of the identification of camptothecin skeleton are basically consistent with those reported in the literature. In this study, the number 6 carbon of camptothecin skeleton and the number 3’ carbon of benzene are completely overlapped. This phenomenon is seldom seen in the13C NMR spectra. NMR data support for the discovery and structural identification of natural products of camptothecin derivatives can be obtained in the study. Furthermore, a methodology was involved in the analysis of NMR spectra.

camptothecin derivative; CPT-A; NMR; analysis of spectrum; structure identification

研究报告(208～213)

2017-11-24;

2017-11-30.

中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目(项目编号：lg201509)资助

高旭东(1987-)，男，工程师，主要从事核磁共振谱仪的分析检测工作，E-mail: sunshinegung@126.com

师彦平(1965-)，男，研究员，《分析测试技术与仪器》主编，研究方向：分离分析、分析方法和药物活性成分的分离鉴定, Tel: 0931-4968208，E-mail: shiyp@licp.cas.cn.

O657.3

A

1006-3757(2017)04-0208-06

10.16495/j.1006-3757.2017.04.002