石河子地区棉花苗期叶斑病病原菌种类鉴定

(石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆石河子 832003)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.013

石河子地区棉花苗期叶斑病病原菌种类鉴定

李映程，张国丽，杨 超，任毓忠，李 卓，张 莉，李国英

(石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆石河子 832003)

目的研究石河子地区棉花苗期叶斑病病原菌种类。方法棉花苗期，采集石河子地区典型叶斑病样120个，用常规组织分离法进行分离和纯化，共得到105个链格孢属(Alternariaspp.)菌株，选取其中15个代表性菌株，通过致病性测定、常规形态学鉴定及组蛋白3基因序列分析，对病原菌种类进行鉴定。结果供试15个代表性菌株均具有致病性。形态学测定，可将其鉴定为A.alternata和A.tenuissima两类；基于组蛋白3基因序列分析，前一类与A.alternata(AF404620、KF997067和KR866858)相似性达99%，后一类与A.tenuissima(KT384348)相似性达99%以上。结论2016年引起石河子地区棉花苗期叶斑病的病原菌为A.alternata和A.tenuissima。

棉苗叶斑病；病原菌；鉴定

0 引 言

【研究意义】棉花叶斑病是新疆棉花上的一种常见病害，但对其缺乏比较系统地研究。2016年4月下旬和整个5月北疆棉区低温高湿，棉花苗期叶斑病大发生，发病率高达100%，尽快搞清其病原种类对其防治具有十分重要的意义。【前人研究进展】棉花叶斑病是一种世界性病害，其中链格孢菌(Alternariaspp)是一类重要的病原，但各地报道引起叶斑病的链格孢菌种类存在较大差异。田逢秀[1](1995)、简桂良[2](2003)认为引起我国棉花轮纹斑的链格孢菌以大孢链格孢菌(A.macrospora)、细极链格孢(A.tenuissima)和棉链格孢菌(A.gossypina)等为常见；李莎[3](2011)认为引起轮纹斑病的链格孢菌94%由链格孢菌 (A.alternata)引起，6%由大孢链格孢菌(A.macrospora)引起；贾菊生[4]鉴定引起新疆棉花叶斑病的病菌主要是链格孢菌(A.alternata)和大孢链格孢菌(A.macrospora)。近年来研究证明，链格孢属级特征明显，种级特征变异较大，所以仅根据形态特征进行种的鉴定比较困难，特别是链格孢属小孢子组的一些种，必须结合分子生物学的手段，才能将其准确鉴定到种[5，6]。【本研究切入点】根据王泰云[7](2014)、杨超[8](2017)研究，通过系统发育分析组蛋白3基因序列，可以较好的分辨出小孢子链格孢类群。研究通过组蛋白3基因序列分析，结合其形态特征，进一步对石河子棉区棉花叶斑病菌进行鉴定。【拟解决的关键问题】根据病原的形态特征，结合组蛋白3基因序列分析，进一步查明新疆石河子地区棉花苗期叶斑病的病原种类。

1 材料与方法

1.1 材 料

2016年春季由于石河子地区持续低温多雨，棉花叶斑病大发生，为鉴定其病原，分别从石河子大学试验站、新疆农垦科学院、121团、143团、石河子总场、148团进行调查，并采集具有典型叶斑症状的120个病样供分离鉴定。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分离与纯化

采用常规组织分离法进行分离，首先将具典型症状的发病叶片用自来水清洗干净，然后在病健交界处切取0.5 cm×0.5 cm的小块，用0.1%的升汞处理5～10 s，后用无菌水清洗3遍，再用无菌的吸水纸将病组织上的水分吸干，最后将其移入PDA平板上，将其置于25℃恒温培养箱中，培养3 d后观察分离结果，并采用常规稀释法[9]进行单孢分离纯化，将纯化的菌株接于PDA斜面培养基上，培养5 d后置4 ℃冰箱中储存备用。

1.2.2 病原菌的致病性测定

采用离体叶片接种法。采集植株相同部位的健康叶片，清洗干净，用75%酒精轻轻擦拭叶片表面，消除杂菌，再用无菌的缝衣针轻轻刺伤叶片表面，4℃处理24 h后接种；用少量无菌水洗下PDA平板培养了7 d的分生孢子，用血球计数板测量孢子浓度，配置成1×107个/mL分生孢子的悬浮液，采用喷雾法进行接种，待叶片表面布满小液滴为好，以无菌水为对照，置于(12×12) cm垫有湿润无菌滤纸的发芽盒中，在智能光照培养箱中，白天18℃，夜间12℃培养，定期观察并记录发病情况。发病后，观察其症状并进行分离，镜检与原接种菌的异同。

1.2.3 病原菌鉴定

1.2.3.1 病原菌的形态学鉴定

用刀片直接在病斑上刮取分生孢子，在光学显微镜下观察其形态、颜色和分生孢子的纵横隔膜数，并测量50个分生孢子的大小。在无菌操作下，根据采集地点和分离菌株的数量，选取15个具有代表性的菌株，分别将其转接到PDA平板上，25℃恒温培养7 d，观察各菌落的颜色并记录其形态特征。采用常规的玻片培养法[10]，25℃下培养5 d，观察并记录分生孢子的着生状态并拍照，参照张天宇[11]对病原菌进行形态学鉴定。

1.2.3.2 病原菌的分子生物学鉴定

将供试15个代表性菌株转接到PDA平板上，25℃恒温培养7 d后，用灭菌刀片刮取菌丝于无菌的研钵中，加液氮冷冻充分研磨，收集研磨物，采用BioFlux试剂盒提取真菌基因组DNA。采用引物H3-1a(5’-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3’)和H3-1b (5’-GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT-3’，由上海生物工程股份有限公司合成)，PCR扩增各试验菌株组蛋白3基因的部分编码序列[7]。反应程序：96℃预变性2 min；96℃变性15 s，55℃退火30 s，75℃延伸35 s，共30个循环；最后72℃延伸2 min，反应体系为25 μL。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像仪上观察并拍照。在ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪下切取目的条带，使用全式金凝胶回收试剂盒(Easy Pure Quick Gel Extraction Kit)回收目的片段。将回收纯化的目的片段直接与pMD19-T载体连接，在4℃下孵育过夜。连接产物通过热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。转化菌液涂布于加有Amp的麦康凯平板上，37℃恒温培养过夜，直至长出单菌落。挑取白斑菌落，进行PCR检测筛选阳性克隆，筛选出的阳性转化子穿刺于LB固体培养基中，送到上海生物工程有限公司测序。

将供试菌株的组蛋白3基因部分序列的测序结果在NCBI上进行Blast比对，应用MEGA 5.0软件中的临近法(neighbor-joining，NJ)构建病原菌系统发育树，分析菌株间的亲缘关系，确定分类地位。

2 结果与分析

2.1 棉苗叶斑病的症状

2016年经在石河子地区6个棉田单位调查，棉花叶斑病在石河子大学试验站、新疆农垦科学院、121团、143团、石河子总场、148团均发生严重，发病率高达100%。其田间症状表现为：发病初期子叶上产生近圆形或不规则形的黑褐色小点，后逐渐扩展成近圆形或不规则形，直径2～3 mm的病斑，边缘常有清晰的黄褐色晕圈，严重时病斑相互愈合形成较大的褐色枯死斑，引起叶片枯焦或病斑脱落成穿孔。人工接种一般5 d左右开始出现水浸状的斑点，稍微扩展后组织坏死，产生与田间相似的症状 。图1

2.2 病原菌分离及代表性菌株的选择

从石河子地区共采集具有典型叶斑症状的病样120个，成功分离出105个链格孢属(Alternariaspp.)菌株，分离率为87.50%。依据采集地点、分离菌株的数量，选取15个具有代表性的菌株，供病原鉴定。表1

表1 菌株编号及来源
Table 1 Number and source of strain

序号Ordernumber菌株编号Strain采集地点Origin采集时间Acquisitiontime1121-1石河子地区121团2016年5月24-3石河子总场3连2016年5月34-9Ld石河子总场9连2016年5月4148-4-2石河子地区148团2016年5月5148-10-1石河子地区148团2016年5月6148-11-3石河子地区148团2016年5月7S1石河子大学试验站2016年4月8SN2石河子农垦科学院2016年5月9121-2石河子地区121团2016年5月10143-9-1石河子地区143团2016年5月11143-8-8石河子地区143团2016年5月11143-2石河子地区143团2016年5月134-9Lx石河子总场9连2016年5月144-9-4石河子总场9连2016年5月15148-8-3石河子地区148团2016年5月

2.3 病原菌的致病性测定

室内接种5 d后，叶片开始出现黑褐色斑点，以后组织坏死呈褐色斑点，症状与田间病害症状相似，15个代表性菌株均会引起叶片发病，对照组棉花叶片则未出现症状。从发病组织中再次分离的菌株与原接种菌形态特征一致。根据柯赫氏法则，说明供试菌株就是造成田间棉花叶斑病的病原菌。图1

注：A:接种细极链格孢菌；B:接种链格孢菌；C:田间症状

Note: A:A.alternatainoculated； B: extremely fineA.tenuissimainoculated； C: symptoms in the field

图1 棉花苗期叶斑病症状
Fig.1 Symptoms of leaf spot of cotton seedling

2.4 棉花叶斑病的病原菌鉴定

2.4.1 形态学鉴定

通过观察，可将供试菌株分为两类。一类在PDA培养基上培养7 d后，其菌落中央略微隆起，褐色或深褐色，毛毡状，分生孢子梗单生或簇生，直立或弯曲，分生孢子单生或2～11个串生，黄褐色或褐色，棒状、倒梨形，有喙或无喙，喙孢锥形或短柱状，孢身表面有刺突，具0～7个横隔，0～2个纵膈或斜隔，大小为(12.5～35.0) μm×(5.0～12.5) μm。将其初步鉴定为A.alternata。图2A、C、E

另一类在PDA上培养7 d产生的菌落，中央略微隆起，灰白色至深灰绿色或深橄榄绿色，绒毛状。分生孢子梗单生或簇生，直立或曲膝状弯曲，分生孢子倒棍棒形、卵圆形或近椭圆形，淡褐色至暗褐色，单生或7～15个串生，有喙或无喙，喙孢锥形或短柱状，孢身表面有刺突，具0～6个横隔，0～2个纵隔或斜隔，大小为(7.5～30.0) μm×(5.0～10.0) μm。将这些菌株初步鉴定为A.tenuissima(图2 B、D、F)。可见两者在形态上比较相似，差别较小。图2

2.4.2 分子生物学鉴定

采用H3-1a/H3-1b引物对15种代表性菌株的基因组DNA进行扩增，分别扩增出大小为546和494 bp的片段。经BLAST比对，所测1～6号菌株与A.tenuissima(KT384348)相似性达100%，与A.tenuissima(KT384290)相似性达99%；7～15号菌株与A.alternata(AF404620、KF997067和KR866858)相似性达99%。表1，图3

通过构建系统进化树发现，用组蛋白3基因很容易将供试菌株区分为两个类群，即A.alternata和A.tenuissima，且A.alternata比例高于A.tenuissima，但所有供试菌株与大链格孢A.macrospora都不聚在一起，说明在石河子棉区苗期暂未发现由A.macrospora引起的叶斑病。图4

图2 链格孢(A、C、E)和细极链格孢(B、D、F)菌落、分生孢子及着生方式
Fig.2 A.alternata (A、C、E) and A.tenuissima (B、D、F) colonies, sub spore and the mode of production

注：第1～6为A.tenuissima；7～15为A.alternata；16为阴性对照；M为标准分子大小DL，2 000 bp

Note： 1-6:A.tenuissima; 7-15:A.alternataand 16: negative control; lane M:molecular size marker DL, 2,000 bp

图3 病原菌组蛋白3基因PCR扩增
Fig.3 The result of the PCR of pathogen's histone 3 gene segment

图4 病原菌与相似种组蛋白3基因序列发育树
Fig.4 Dendrogram of histone 3 gene sequences of the pathogen and its related

3 讨 论

据刘伟[12]报道，棉花叶斑病多发生于棉花幼苗期子叶及成株期叶片，若此时阴雨连绵、大量降雨，气温偏低，易造成该病流行，这与2016年4～5月石河子地区棉花叶斑病大爆发的情况类似。

关于由链格孢菌引起的棉花叶斑病病原种类，不同地区存在明显差异。Sciumbato G L和Pinckard J A[13](1972)报道印度棉花轮纹斑病是由大孢链格孢菌引起的；美国的密苏里、路易斯安那州以及以色列是由大孢链格孢造成的。在国内，简桂良[2](2003)认为棉轮纹斑病由多种链格孢菌引起，其中主要为A.tenuissima。有文献报道[14]，棉轮纹斑病以大孢链格孢(A.macrocpora)、细极链格孢(A.tenuissima)和棉链格孢(A.gossypina)等为常见种，最常见的为大孢链格孢(A.macrospora)。李莎等[3]经鉴定，认为在国内该病94%主要由链格孢菌(A.alternata)引起，6%由大孢链格孢菌(A.macrospora)引起。贾菊生[4](1994)通过采集南北疆病样鉴定，认为石河子和玛纳斯棉区的叶斑病病原为A.arternata。这次以形态学特征同时结合组蛋白3基因序列分析，将引起石河子棉区苗期叶斑病的病原鉴定为两个种，即A.alternata和A.tenuissima，没有发现大孢链格孢(A.macrocpora)和棉链格孢(A.gossypina)。

在链格孢菌中，A.alternata和A.tenuissima都属于小孢子种。大量研究证明，链格孢菌的分生孢子梗及孢子的形态、大小受环境影响较大，即使在相同的培养条件下，不同种孢子形态容易趋同，给准确鉴定造成很大障碍，特别是链格孢菌小孢子种在人工培养条件下孢子形状、大小有趋同倾向，单凭形态学特征很难将其鉴定到种。近年来，结合分子生物学技术在病原菌鉴定方面的应用越来越多。王洪凯等[15]研究发现ITS、mt LSU、b/ eta-tubulin、EF-1α、CAL、ACT和CHS等核苷酸序列在小孢子链格孢种间差异很小或没有差异，不能准确区分小孢子链格孢种。研究采用特异性引物H3-1a/H3-1b，对组蛋白3基因序列分析，能够很好的将这两个小孢子链格孢种进行区分，这一研究结果与王泰云等[7]报道的结果一致。

4 结 论

经对石河子棉区所采120个典型叶斑病样分离培养和鉴定，分离出105个链格孢属(Alternariaspp.)菌株，分离率为87.50%。选用其中15个代表性菌株进行致病性测定都可引起叶斑病，说明链格孢菌 (Alternariaspp.)是引起叶斑病的主要病原。经形态学鉴定和致病性测定,以及采用特异性引物H3-1a/H3-1b，对组蛋白3基因序列分析，能够很好将其分为两个种，即链格孢(A.alternata)和细极链格孢(A.tenuissima)，其中链格孢占60%，细极链格孢占40%。两者形态比较相似，仅凭形态学很难将两者进行区别，通过系统发育分析组蛋白3基因序列，能够很好的将两者区别开来。2016年在石河子棉区苗期严重发生的叶斑病，主要由链格孢(A.alternata)和细极链格孢(A.tenuissima)引起。

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IdentificationofPathogensCausingLeafSpotDiseaseatCottonSeedlingStageinShiheziArea

LI Ying-cheng, ZHANG Guo-li, YANG Chao, REN Yu-zhong, LI Zhuo, ZHANG Li, LI Guo-ying

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

ObjectiveThe aim of the study is to verify the pathogens that cause cotton seedling leaf spot in Shihezi area.Method120 samples of cotton leaf spot were collected from Shihezi area, and 105 strains ofAlternariaspp were isolated and purified by conventional method, and 15 representative strains were identified through survey of morphological characteristics, test of pathogenicity and sequence analysis of histone 3 gene.ResultThe selected 15 representative strains were pathogenic. The pathogens were preliminarily identified asA.alternataandA.tenuissimaaccording to morphological characteristics, respectively. Based on histone 3 gene sequence analysis, the results showed that the similarity of nucleotide homogeneity ofA.alternata(AF404620, KF997067 and KR866858) was 99% andA.tenuissima(KT384348) was more than 99%, respectively.ConclusionThe pathogens causing cotton seedling leaf spot areA.alternataandA.tenuissimain Shihezi in 2016.

cotton seedling leaf spot; pathogen; identification

Supported by: Selection of High-yield and Fine-quality Peanuts Varieties and Study on the Cultivation(2016B01008-2)

LI Guo-ying(1941-), male, native place: Hebei, Professor, research field: plant pathogenic fungi and fungal diseases. (E-mail)lgyshzu@163.com

ZHANG Li(1970-), female, native place: Jiangsu, Ph. D., research field: plant pathology. (E-mail)1602784618@qq.com

S435.621

A

1001-4330(2017)11-2060-07

2017-08-28

科技部中小企业创新项目(14C26216513812)

李映程(1994-)，男，甘肃人，硕士，研究方向为植物病理学，(E-mail)1363731850@qq.com

李国英(1941-)，男，河北人，教授，研究方向为植物病原真菌和真菌病害，(E-mail)lgyshzu@163.com

张莉(1970-)，女，江苏人，教授，博士，研究方向为植物病理学，(E-mail)1602784618@qq.com