趋化因子SDF-1促进基于内源性干细胞归巢的初步研究

黄晓 陈晖 刘玉健 汪俊

趋化因子SDF-1促进基于内源性干细胞归巢的初步研究

黄晓 陈晖 刘玉健 汪俊

目的 通过体内、外实验，研究基质细胞衍生因子1（Stromal cell–derived factor-1，SDF1）对细胞的趋化作用。方法 体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）。通过Transwell实验，检测不同浓度SDF1对BMSC体外趋化作用的影响。采用MTT法，检测不同浓度SDF1对BMSC细胞活性的影响。通过将负载SDF1的无纺聚羟基乙酸植入裸鼠皮下，检测SDF1的体内趋化活性。结果 10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL SDF1组体外趋化BMSC数目均较对照组增加，其中100 ng/mL SDF1组趋化细胞数目最高。10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL SDF1对BMSC细胞活性无影响，200 ng/mL SDF1可降低BMSC细胞活性。100 ng/mL SDF1可促进体内细胞募集。结论100 ng/mL SDF1可有效促进细胞趋化且对细胞活性无影响。

基质细胞衍生因子1 骨髓间充质干细胞 干细胞募集 趋化作用

全脱位牙外伤是青少年最常见的牙外伤之一，最常累及的人群是8～9岁的儿童[1]。目前，牙再植是治疗全脱位牙外伤的主要方法[2-3]。但是，全脱位牙再植，尤其是延时再植后，患牙牙根常发生替代性吸收，最终导致患牙丧失[4-5]。由于全脱位最常累及的牙位为上颌中切牙，因此牙再植的失败不仅严重影响患儿牙颌系统的发育，也会对患儿的发音、美观及心理等产生不良影响，提高牙再植的成功率一直是儿童牙科面临的一大挑战。

牙根替代吸收是牙再植失败最主要的原因，其根源在于患牙根面缺乏足够的活性牙周膜细胞。此时相邻骨髓腔内骨内膜细胞异常增生，分化出破牙细胞，竞争性附着到牙根面，导致牙根发生替代性吸收，最终导致患牙丧失[6]。因此，有效促进再植牙牙周组织的再生，恢复牙周组织的正常结构和功能是全脱位牙延时再植成功的关键。相关研究已证实，根面细胞移植可明显改善全脱位牙再植的预后[7-10]。但细胞移植存在诸多缺点，如细胞来源难以解决，细胞培养操作复杂，费用高，耗时长，难以进行临床转化等[11-12]。因此，寻找新的、易于临床转化的、能够促进再植牙牙周组织再生的方法势在必行。

随着组织工程和再生医学的发展，研究发现人体的多种组织中均存在内源性前体/干细胞，通过诱导内源性干细胞归巢也可以促进组织再生修复[13-14]。这种基于干细胞归巢的内源性再生技术已成为一种新的理念，并在多个医学领域得到了证实。但该理念是否有助于全脱牙再植时牙周膜的再生、提高再植成功率，目前尚无报道。该理念的关键在于有效地募集内源性干细胞归巢，以最大限度地获得再生细胞来源[15-16]。目前，促进内源性干细胞向靶位点归巢最经典的方法就是通过趋化因子募集。趋化因子基质细胞衍生因子-1（Stromal cell derived factor-1，SDF-1）是CXC类趋化因子，通过与CXCR4受体结合被激活[16-17]。大量研究显示，损伤部位上调的SDF-1可有效募集循环系统或损伤部位留存的CXCR4+间充质细胞及前体细胞到达损伤部位，修复受损组织[18-20]。全脱位后牙周组织被破坏，牙周组织再生的前体/干细胞来源主要是骨髓间充质干细胞 （Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）[4，14]，为 CXCR4+干细胞[18]。因此，本研究拟通过体内、外实验，验证SDF-1对于BMSCs趋化作用的影响，为将其用于全脱位牙再植的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄雌性未孕SD大鼠及6周龄雌性裸鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF动物房，动物使用许可证号SCXK（沪）2012-0007。本实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的 《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要材料及试剂

DMEM培养液（HyClone，美国），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素链霉素（Gibco，美国），胰蛋白酶（HyClone，美国），PBS、4%多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司），重组人基质细胞衍生因子 （Peprotech，美国），MTT试剂盒（Sigma，美国）。

超净工作台 （苏净集团），CO2恒温细胞培养箱（Thermo Scientific，美国），倒置相差显微镜（Olympus，日本），Transwell（Corning，美国），恒温水浴箱（Shellab，美国），高速离心机（Eppendorf，德国），震荡仪（跃进仪器厂），Human Reader 酶标仪（Human，德国）。

1.3 BMSCs的分离、培养和纯化

采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs。取4周龄雌性未孕SD大鼠股骨及胫骨，以5 mL注射器吸取DMEM培养液，将骨髓冲至离心管内，1 500 r/min离心10 min，弃上清，采用DMEM完全培养液（含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素）重悬细胞，选用10 cm培养皿，37℃、5%CO2培养箱培养，5 d后换液去除未贴壁细胞。以后每3天换液，逐步去除未贴壁红细胞，待细胞长至80%～90%融合时传代培养。选用第3代BMSCs进行实验。

1.4 Transwell体外趋化实验

以 24孔板 Transwell（8 μm 聚碳酸酯膜）行体外趋化实验。将BMSCs用胰酶消化，细胞计数仪计数后将细胞密度调整为1×105cells/mL，向小室的上室中加入细胞悬液200 μL，下室分别加入含不同种浓度 SDF1 （10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL）的 DMEM 培养液 700 μL；对照组为不含 SDF1的DMEM培养液。每组设2个复孔。将Transwell放入37℃、5%CO2培养箱中培养15 h，取出 Transwell，弃掉上室培养液，PBS洗2遍，用棉签将聚碳酸酯膜上细胞擦掉，4%多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗2遍，苏木精染色30 min，流水冲洗15 min，倒置相差显微镜下观察拍照，每个复孔随机选取5个视野进行计数统计。

1.5 MTT检测细胞活性

将第3代BMSCs用胰酶消化、重悬、计数，以2×104cells/mL的密度接种入96孔板，每孔200 μL，每组设5个复孔。培养箱培养过夜，弃去原培养液，分别加入含不同种浓度SDF1的DMEM培养液（对照组、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL）。将96孔板于培养箱培养，分别于第1、4、7天取出一块96孔板，每孔加入20 μL MTT，放入培养箱避光孵育4 h，取出培养板，吸掉培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），震荡仪震荡10 min，使用酶标仪测定490 nm波长下的吸光度。以时间为横轴，相对MTT值为纵轴，绘制细胞增殖曲线。

1.6 体内趋化实验

1.6.1 制备负载趋化因子的PLGA材料

15 mg无纺聚羟基乙酸（PLGA）纤维均匀放入圆柱状硅胶模具（直径4 mm，高2 mm）内，过夜后取出，将0.1%的聚乳酸（PLA）溶液均匀滴至PLGA内，自然风干后，用75%乙醇消毒30 min，PBS冲洗3遍，吸干，紫外线消毒2 h后无菌储存备用。

配制100 ng/mL的SDF1胶原溶液 （Ⅰ型胶原的浓度为2 mg/mL）。将实验组的PLGA材料浸泡于含SDF1的胶原溶液中10 min，对照组PLGA材料浸泡于不含SDF1因子的胶原溶液中10 min。

1.6.2 因子/PLGA材料复合物回植

裸鼠皮肤消毒，将各组的因子/PLGA材料复合物接种至裸鼠右侧背部皮下，每组3只。

1.6.3 样本组织学分析

分别于回植1周、2周后取材，4%多聚甲醛固定24 h，将标本流水冲洗 30 min，50%、75%、85%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯浸泡30 min，石蜡包埋、切片（厚度4 μm），HE染色。光学显微镜观察，每组切片随机选取5个视野拍照，细胞计数统计。

1.7 统计学分析

采用SPSS16.0进行统计学分析，数据以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SDF1促进BMSCs募集

Transwell实验检测不同浓度SDF1对BMSCs趋化作用的影响。结果显示：与对照组相比，10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL SDF1 组趋化细胞数目均显著增加（P＜0.05），其中 100 ng/mL SDF1 组趋化细胞数目最多。表明SDF1可促进BMSCs募集，SDF1浓度为100 ng/mL时具有最佳的趋化效应（图 1）。

图1 不同浓度SDF1对BMSCs的趋化作用（*：P＜0.05，n=3）Fig.1 The chemotaxis of SDF1 with different concentration on BMSCs(*:P＜0.05,n=3)

2.2 SDF-1对BMSCs细胞活力的影响

MTT实验检测不同浓度SDF1作用下BMSCs细胞活性的改变。结果显示，10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL SDF1组在第1、4、7天时细胞活性与对照组均无显著差别（P＞0.05），而 200 ng/mL SDF1 组在第 1、4、7 天时细胞活性均较对照组下降（P＜0.05）。由此可见，SDF1浓度≤100 ng/mL时，对BMSCs细胞活力无影响（图2）。

图2 不同浓度SDF1对BMSCs细胞活性的影响（*：P＜0.05，n=6）Fig.2 The influences of SDF1 with different concentrations on cell viability of BMSCs(*:P＜0.05,n=6)

2.3 SDF-1促进体内干细胞募集

基于上述体外实验的结果，我们以100 ng/mL的SDF1进行后续的体内趋化和组织再生实验。通过胶原溶液将SDF1负载至PLGA支架内，并以单纯胶原溶液负载PLGA支架作为对照，将两组材料植入裸鼠皮下。再植1周时，HE染色示SDF1组内细胞数多于对照组；2周时的结果与1周时基本一致。说明SDF1可促进体内细胞募集（图3）。

图3 负载SDF1的PLGA支架材料与对照组接种裸鼠1周及2周后的HE染色Fig.3 The HE staining of the SDF1-loaded PLGA and the control PLGA after implanted for 1 week and 2 weeks

3 讨论

青少年儿童全脱位牙外伤主要累及中切牙，目前牙再植仍然是治疗全脱位牙外伤的主要方法[1，3]。然而，由于受到各种条件的限制，患儿就诊时，牙脱位时间基本都较长，通常患牙也未受到良好的保护。当患牙脱离牙槽窝时间过长，又未能妥善保存，根面牙周膜细胞会受环境（如干燥）、营养缺乏等不良因素影响，而导致丧失活性或死亡。牙再植后常由于患牙周围缺少具有活性的细胞，导致破牙细胞竞争性附着到牙根面、牙根，发生替代性吸收，最终使得牙再植失败[15]。因此，防治牙根发生替代性吸收是提高牙再植成功率的关键，而其重点在于增加患牙周围的活细胞数目。近年来的研究发现，通过募集干细胞/前体细胞至指定区域，可以实现组织再生的目的。目前，该技术能否应用于全脱位牙再植仍不明了。该技术的关键在于募集足够的干细胞/前体细胞，最常用的方法为趋化因子募集法[14]。

趋化因子是能使细胞发生趋化作用的细胞因子的总称，目前有50多种，是一类分子量为8～10 Kda的小分子量蛋白质，分为CXC、CC、C和CX3C四大亚家族[21]。SDF-1是应用最广泛的一类趋化因子，属于CXC类家族，系统命名为CXCL12。SDF1通过与特异性且唯一性受体CXCR4结合，激活受体偶联蛋白，并进一步激活下游途径。研究显示，损伤部位上调的SDF1可有效募集循环系统或损伤部位留存的CXCR4+间充质细胞及前体细胞到达损伤部位，修复受损的组织[9－10，18，22]。 另外，口腔领域的相关研究发现，在炎症性牙髓组织中，SDF1-CXCR4轴存在于微血管内皮细胞中，并在微血管的周围分布着大量的牙髓细胞，SDF1-CXCR4轴可有效募集牙髓干细胞从干细胞巢到达损伤区域，参与牙髓组织的再生[21]。研究已经证实了BMSC在牙周组织的再生中发挥着重要作用，且BMSC为CXCR4+间充质干细胞[18，23－24]。 本研究的体外实验证实，10～200 ng/mL 浓度的SDF1均对BMSC有趋化作用，其中SDF1浓度在100 ng/mL时趋化的细胞最多，表明该浓度下SDF1具有较强的趋化效应。同时，通过细胞活性检测发现，当SDF1浓度在100 ng/mL及以下时对BMSCs活性无影响。因此，体内实验部分采用的SDF1浓度为100 ng/mL。在该浓度下，SDF1趋化作用较强的同时细胞毒性较小。当将负载SDF1的PLGA材料植入裸鼠皮下后发现，SDF1可促进细胞的募集，这可能会进一步促进组织再生。上述实验结果为SDF1应用于牙周组织的再生奠定了基础。

4 结论

本研究通过体外实验证实100 ng/mL SDF1可有效促进BMSCs趋化，且对BMSCs活性无明显抑制作用，体内试验表明100 ng/mL SDF1可促进细胞募集，这为SDF1应用于基于干细胞归巢的牙周组织再生奠定了基础。然而，SDF1体内趋化的是细胞种类，以及这些细胞在组织再生中发挥的功能等，尚需进一步探讨。

[1] 葛立宏.儿童口腔医学[M].北京:人民卫生出版社,2012.

[2] Trope M.Clinical management of the avulsed tooth:present strategies and future directions[J].Dent Traumatol,2002,18(1):1-11.

[3] Pohl Y,Filippi A,Kirschner H.Results after replantation of avulsed permanent teeth.I.Endodontic considerations[J].Dent Traumatol,2005,21(2):80-92.

[4] Pohl Y,Filippi A,Kirschner H.Results after replantation of avulsed permanent teeth.II.Periodontal healing and the role of physiologic storage and antiresorptive-regenerative therapy[J].Dent Traumatol,2005,21(2):93-101.

[5] Pohl Y,Wahl G,Filippi A,et al.Results after replantation of avulsed permanent teeth.III.Tooth loss and survival analysis[J].Dent Traumatol,2005,21(2):102-110.

[6] Loe H,Waerhaug J.Experimental replantation of teeth in dogs and monkeys[J].Arch Oral Biol,1961,3:176-184.

[7] van Dijk LJ,Schakenraad JM,van der Voort HM,et al.Cellseeding of periodontal ligament fibroblasts.A novel technique to create new attachment.A pilot study[J].J Clin Periodontol,1991,18(3):196-199.

[8] Wang Y,Cheung GS,Xu X,et al.The effect of cultured autologous periodontal ligament cells on the healing of delayed autotransplanted dog's teeth[J].J Endod,2010,36(2):264-267.

[9] Zhou Y,Li Y,Mao L,et al.Periodontal healing by periodontal ligament cell sheets in a teeth replantation model[J].Arch Oral Biol,2012,57(2):169-176.

[10] Daley GQ,Scadden DT.Prospects for stem cell-based therapy[J].Cell,2008,132(4):544-548.

[11] Assady S.Challenges and prospects for stem cell-based therapy in diabetes mellitus[J].Isr Med Assoc J,2009,11(4):212-215.

[12] Müller R,Lengerke C.Patient-specific pluripotent stem cells:promises and challenges[J].Nat Rev Endocrinol,2009,5(4):195-203.

[13] Kim K,Lee CH,Kim BK,et al.Anatomically shaped tooth and periodontal regeneration by cell homing[J].J Dent Res,2010,89(8):842-847.

[14] Kim JY,Xin X,Moioli EK,et al.Regeneration of dental-pulplike tissue by chemotaxis-induced cell homing[J].Tissue Eng Part A,2010,16(10):3023-3031.

[15] Khaldoyanidi S.Directing stem cell homing[J].Cell Stem Cell,2008,2(3):198-200.

[16] Lau TT,Wang DA.Stromal cell-derived factor-1(SDF-1):homing factor for engineered regenerative medicine[J].Expert Opin Biol Ther,2011,11(2):189-197.

[17] Kortesidis A,Zannettino A,Isenmann S,et al.Stromal-derived factor-1 promotes the growth,survival,and development of human bone marrow stromal stem cells[J].Blood,2005,105(10):3793-3801.

[18] Kitaori T,Ito H,Schwarz EM,et al.Stromal cell-derived factor 1/CXCR4 signaling is critical for the recruitment of mesenchymal stem cells to the fracture site during skeletal repair in a mousemodel[J].Arthritis Rheum,2009,60(3):813-823.

[19] Carr AN,Howard BW,Yang HT,et al.Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency:Support for an endothelium-dependent mechanism[J].Cardiovasc Res,2006,69(4):925-935.

[20] Kerfoot SM,Andonegui G,Bonder CS,et al.Exogenous stromal cell-derived factor-1 induces modest leukocyte recruitment in vivo[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,294(6):H2524-H2534.

[21] Vanden Berg-Foels WS.In situ tissue regeneration:chemoattractants for endogenous stem cell recruitment[J].Tissue Eng Part B Rev,2014,20(1):28-39.

[22] Dangaria SJ,Ito Y,Luan X,et al.Successful periodontal ligament regene ration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces[J].Stem Cells Dev,2011,20(10):1659-1668.

[23] Komatsu K,Shimada A,Shibata T,et al.Alendronate promotes bone formation by inhibiting protein prenylation in osteoblasts in rat tooth replantation model[J].J Endocrinol,2013,219(2):145-158.

[24] Kaku M,Kitami M,Rosales Rocabado JM,et al.Recruitment of bone marrow-derived cells to the periodontal ligament via the stromal cell-derived factor-1/C-X-C chemokine receptor type 4 axis[J].J Periodontal Res,2017,52(4):686-694.

A Preliminary Study of SDF-1 in Stem Cell Homing-guided Tissue Regeneration

HUANG Xiao1,CHEN Hui2,LIU Yujian2,WANG Jun2．1 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Stomatological Hospital,Shanghai 200001,China;2 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Key Laboratory of Stomatology,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:WANG Jun (E-mail:wangjun202@126.com).

Objective To investigate the chemotaxis of stromal cell derived factor-1 (SDF1)in vitro and in vivo.Methods Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)were cultivated from SD rats.Transwell test was used to evaluate the influences of different concentration of SDF1 on chemotaxis of BMSC.MTT test was used to analyze the effects of different concentration of SDF1 on the cell viability of BMSC.100 ng/mL SDF1-loaded PLGA was implanted in nude mice to study the the chemotaxis of SDF1 in vivo.Results All 4 groups of SDF1 (10 ng/mL,50 ng/mL,100 ng/mL and 200 ng/mL)recruited more BMSC than the control group,and 100 ng/mL SDF1 showed better results than the other groups.200 ng/mL SDF1 deceased cell viability of BMSC on day 1,4 and 7,while 10 ng/mL,50 ng/mL and 100 ng/mL SDF1 had no effects on the the viability of BMSC.In vivo analysis showed that 100 ng/mL SDF1 could promote cell recruitment.Conclusion 100 ng/mL SDF1 could effectively promote BMSC recruitment without influence on cell viability in vitro and 100 ng/mL SDF1 could promote cell homing in vivo.

Stromal cell derived factor-1;Bone marrow mesenchymal stem cells; Stem cell recruitment; Chemotaxis

Q813.1+1

A

1673－0364（2017）05－0287－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.05.013

200001 上海市 上海市口腔病防治院儿童口腔科（黄晓）；200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院儿童口腔科，上海市口腔医学重点实验室（陈晖，刘玉健，汪俊）。

汪俊（E-mail：wangjun202@126.com）。

2017年7月16日；

2017年8月22日）