重组Periostin蛋白对TWIST1+/-小鼠颅缝细胞增殖以及成骨分化能力的影响

白珊珊 李俊宪 李东 徐梁 段惠川 俞哲元 袁捷 韦敏

重组Periostin蛋白对TWIST1+/-小鼠颅缝细胞增殖以及成骨分化能力的影响

白珊珊 李俊宪 李东 徐梁 段惠川 俞哲元 袁捷 韦敏

目的 观察不同浓度Periostin重组蛋白对体外培养的TWIST1+/-小鼠冠状缝颅缝细胞增殖及成骨分化的影响。方法 取TWIST1+/-小鼠冠状缝颅缝细胞，培养传代后随机分成4组，并分别加入不同浓度的重组Periostin蛋白（0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L）进行培养。 采用 CCK8 法检测该蛋白对颅缝细胞增殖的影响；碱性磷酸酶定量试剂盒检测细胞内ALP的分泌；RT-PCR及Western Blot法检测细胞内成骨分化相关因子基因和蛋白的表达。结果CCK8 法检测结果显示，与 0 μg/L 组相比，Periostin 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 浓度组分别培养 1、3、5、7 d 后，颅缝细胞活性均显著降低（P＜0.05）；碱性磷酸酶试剂盒检测结果显示，与 0 μg/L 组相比，Periostin 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L浓度组分别成骨诱导培养10 d后，ALP活性被抑制，表达量下降（P＜0.05）；RT-PCR和Western Blot检测结果显示，成骨诱导培养 21 d后，与 0 μg/L组相比，Periostin 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L浓度组颅缝细胞成骨分化相关因子 OCN、OPN、BSP、COL-1 表达量下降 （P＜0.05）。 结论 不同浓度 （50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L） 的重组 Periostin 蛋白对TWIST1+/-小鼠冠状缝颅缝细胞增殖、分化均有明显抑制作用。

骨膜蛋白 颅缝细胞 成骨分化

颅缝早闭，又称为狭颅症，或者颅狭窄畸形，系一条或多条颅缝早期闭合或骨化所致的颅骨发育异常，可独立发生也可合并于其他综合征中[1]。颅缝早闭引起颅内容物发育受限，影响脑的生长发育，可引起头面部畸形、发育迟缓、智力下降等[2]。颅缝早闭的治疗主要以手术为主，非手术靶向治疗亟待探索和研究。目前研究表明，颅缝细胞生长过程中的异常增殖及成骨分化是导致颅缝闭合的重要机理之一。Periostin是一种分泌型的细胞外基质蛋白，主要由成骨细胞及前体细胞所分泌产生，在骨发育和成熟过程中具有不同的功能[3]。Saethre-Chotzen综合征是颅缝早闭的一种，其基因定位主要位于TWIST1[4]，TWIST1+/-小鼠为该综合征的疾病模型，此模型小鼠冠状缝于10 d左右提前闭合，造成颅缝早闭，与Saethre-Chotzen综合征患者的颅缝早闭时间及部位均符合，临床上应用此模型研究颅缝早闭疾病机理。本研究旨在探讨重组Periostin蛋白对TWIST1+/-小鼠冠状缝颅缝细胞的增殖和成骨分化的作用，从而为Periostin蛋白治疗颅缝早闭提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

出生24 h之内的C57TWIST1+/-小鼠30只 （美国贝乐医学院捐赠），SPF级，雌雄各半，饲养于我院动物房。 许可证号：SYXK（沪）2016-0016。

1.1.2 主要试剂

小鼠重组Periostin蛋白 （美国Sigma公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），低糖DMEM培养液、成骨诱导液、胰蛋白酶（美国Gibco公司），Ⅳ型胶原酶、CCK-8试剂盒 （美国Beyotime公司），ALP定量试剂盒（中国联科生物技术有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo公司），M-MLV反转录及相关试剂 （美国Promega公司），SYBRPremix Ex TagⅡ试剂盒 （日本Takara公司），抗OCN、OPN、BSP、Col-1 抗体（美国 Sigma公司）。

1.1.3 主要仪器

CO2培养箱（中国Heal Forse公司），倒置显微镜及摄像系统 （日本 Olympus公司），全波长酶标仪、流式细胞检测仪（美国Beckman Coulter公司），荧光定量PCR仪（美国Agilent Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠颅缝细胞培养

取出生后1 d的C57TWIST1+/-小鼠，乙醇浸泡消毒，无菌条件下切取颅盖骨，剥离硬脑膜和骨膜，取颅骨冠状缝处1.5 mm组织，尽量剪碎，放入4 mLⅣ型胶原蛋白酶内，37℃，3 h；离心弃上清液。10 mL完全培养液（低糖DMEM+10%FBS+1%青链霉素原液+292 mg/L L-谷氨酰胺）重悬细胞，无菌转移至培养皿中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养。3 d换液一次，1周后0.25%胰蛋白酶消化，按1×104cells/cm2的细胞密度接种于培养皿。实验用第一代细胞。

1.2.2 Perostin蛋白对颅缝细胞增殖的检测

取第1代生长良好的细胞，按3.0×104cells/mL的密度接种于96孔培养板中，并分别加入浓度为0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的重组 Periostin蛋白，每组设3个复孔。分别于加药1 h、3 h、5 h、7 h后，每孔加入CCK-8检测液10 μL，在37℃、5%CO2培养箱中孵育3 h，于450 nm波长处，酶标仪检测各孔光密度值（OD）值。

1.2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性检测

取第1代生长良好的细胞，按5.0×104cells/mL的密度接种于96孔板，24 h后换成骨诱导培养液，并分别按照浓度 0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L加入重组Periostin蛋白，每组设置3个复孔，分别于培养3 d、5 d、7 d后收集细胞，用0.05%的Triton X-100裂解液进行裂解。严格按照碱性磷酸酶试剂盒说明书检测ALP活性，取50 μL的裂解物于96孔板中，再加50 μL显色底物混匀，37℃避光孵育5 min，加入10 μL终止液终止反应，在405 nm处检测各组样品的吸光度，通过标准曲线计算各组细胞ALP活力。

1.2.5 Real-Time PCR 法检测 OCN、OPN、BSP、COL-1 mRNA表达水平

取第1代生长良好的细胞，按1.0×105cells/mL的密度接种于6孔板，常规低糖DMEM培养24 h后，换成成骨诱导液，并分别按 0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的浓度加入重组Periostin蛋白，每组设3个复孔，按Real-Time PCR试剂盒说明书操作，提取总RNA，反转录为cDNA后，实时定量PCR仪扩增检测。所有引物均由上海生工生物工程公司设计合成。实验结果采用2-△△CT法计算出实验组与对照组的表达差异（表1）。

1.2.6 Western Blot法检测 OCN、OPN、BSP、COL-1蛋白的表达

细胞加入不同浓度（0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L）Periostin成骨诱导培养液培养21 d后，胰酶消化收集，加入RIPA裂解液，提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。蛋白提取液中加入等量的2×十二烷基磺酸钠上样缓冲液，电泳后转膜，膜用TBST配置的50 g/L脱脂牛奶封闭2 h；加入一抗（封闭液稀释），4℃孵育过夜；TBST洗3×10 min。加相应的二抗（封闭液稀释）室温孵育 1 h；TBST洗 3×10 min；用ECL发光法检测不同样品蛋白表达状况；X线胶片曝光，显影，定影。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行数据统计分析，以One-Way ANOVA-Dunnett进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。正态计量数据用（x±s）表示。

2 结果

2.1 重组Periostin蛋白对颅缝细胞增殖的影响

加入重组Periostin蛋白后，CCK-8试剂盒检测结果显示，培养第 3 天，相比 0 μg/L 组，100 μg/L 及200 μg/L 组明显抑制颅缝细胞增殖（P＜0.05），从培养第5天开始，各浓度组对颅缝细胞的增殖均有明显抑制作用（P＜0.05），且 Periostin 浓度为 100 μg/L的时最明显，但100 μg/L组和浓度200 μg/L组之间无统计学差异（P＞0.05）（图 1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2 重组Periostin蛋白对颅缝细胞中碱性磷酸酶含量的影响

与 0 μg/L 组相比，其余各组培养 3 d、5 d、7 d 时，碱性磷酸酶（ALP）量均明显少于 0 μg/L 组（P＜0.05），呈一定时间浓度依赖性（表2）。

2.3 Real-Time PCR 法检测 OCN、OPN、BSP、COL-1 mRNA表达水平

与0μg/L组相比，各浓度Periostin对颅缝细胞成骨分化相关因子 OCN、OPN、BSP、COL-1 mRNA表达水平均有不同程度抑制。当浓度为200 μg/L时，表达水平最低，但其与100 μg/L组之间并无统计学差异（P＞0.05）（图 2）。

2.4 Western Blot法检测 OCN、OPN、BSP、COL-1蛋白表达水平

与0 μg/L组相比，不同浓度Periostin对颅缝细胞成骨分化相关因子 OCN、OPN、BSP、COL-1蛋白水平均有不同程度抑制，随着浓度升高，蛋白表达量降低，在浓度为200 μg/L时，表达量最少（图3）。

表2 不同浓度重组Periostin蛋白对TWIST1+/-小鼠冠状缝颅缝细胞碱性磷酸酶活性的影响Table 2 Effects of different concentrations of recombinant Periostin on ALP activity of cranial suture cells of coronal suture in TWIST1+/-mouse

图1 Periostin对颅缝细胞增殖的影响Fig.1 Periostin on the proliferation of cranial suture cells

图2 Periostin对颅缝细胞成骨分化因子mRNA的影响Fig.2 Periostin on mRNA expression of osteogenic differentiation markers of cranial suture cells

图3 Periostin对颅缝细胞成骨分化因子蛋白的影响Fig.3 Periostin on expression of osteogenic differentiation markers of cranial suture cells

3 讨论

颅缝早闭不仅可导致头颅畸形、面中部严重发育不良，也会造成颅内压增高、视力障碍、中枢神经系统异常、智力低下等。研究证实，多种基因突变、致畸物质、机械压力或血液、代谢紊乱等均是导致颅缝早闭的原因[5]。与长骨不同，颅骨是由膜内成骨发育而来，即间充质细胞不经软骨形成过程，而直接分化为成骨细胞。颅缝的形成过程由多种信号机制参与调控，如 FGFs、BMP、TGF-β、Wnt蛋白等，异常的信号通路可造成颅缝细胞增殖、迁移、成骨能力异常，导致颅缝过早闭合[6]。因此，颅缝早闭的非手术靶向治疗的关键在于抑制和阻止颅缝细胞的过度增殖和异常成骨分化。Saethre-Chotzen综合征是综合征型颅缝早闭的一种，为常染色体显性遗传，通常伴有身材矮小、颅缝早闭、前额突出、眼帘下垂、突出耳垂的小耳、上颌骨发育不全等的畸形[7]，其致病基因为TWIST1基因。TWIST1是一种合子基因，对中胚层形成及其进一步分化为特定组织具有重要作用[8]。该综合症患者的TWIST1基因表达明显下降[9]。Connerney等[10]发现，通过抑制FGF信号通路可以防止TWIST1+/-小鼠颅缝早闭的发生。为进一步探究该疾病的分子机制及非手术治疗方法，本研究采用不同浓度重组Periostin蛋白，观察其对TWIST1+/-小鼠冠状缝颅缝细胞增殖、成骨分化程度的影响。

Periostin（骨膜蛋白），是一种分泌型的细胞外基质蛋白，最初发现于MC3T3-E1成骨细胞样细胞系，在骨、牙周膜、皮肤及心脏瓣膜等多种组织中均有表达，也可见于人类多种恶性肿瘤及创伤愈合的组织中，参与肿瘤侵袭、转移及皮肤损伤和心肌缺血后重建过程[11]。Periostin是骨强度的调控因子之一，在成骨细胞黏附、分化，胶原纤维形成，骨基质的矿化中有调节作用[12]。本研究发现，Periostin可抑制颅缝细胞的增殖，且在浓度为100 μg/L时最明显。Periostin和TWIST的mRNA共表达于颅缝成骨前缘，与颅缝发育有关，提示TWIST1位于Periostin的上游，可调控其表达，TWIST1可使得成骨细胞前体中的Periostin表达增加[13]，故TWIST1+/-小鼠中Periostin表达量减少，而体外给予Periostin，可抑制颅缝细胞增殖。另外，在成骨细胞分化过程中，随着细胞的分化，ALP的表达和分泌会随之增强，ALP活性越强表明成骨细胞骨形成的状况越好。本研究结果显示，随着Periostin蛋白浓度增加，颅缝细胞中ALP逐渐减少。COLI是成骨细胞向基质成熟方向分化的标志，是钙盐沉着以及细胞附着的支架，其合成分泌是骨组织形成的先决条件，而BSP、OCN、OPN均是成骨细胞形成骨基质不可缺少的蛋白，均反映了成骨细胞矿化的能力[14]。因此，本研究选取COLI、SP、OCN、OPN作为颅缝细胞成骨分化的观察指标。RTPCR和Western Blot结果显示，Periostin蛋白可抑制颅缝细胞中成骨相关因子表达，抑制其矿化能力，且在浓度为200 μg/L时最明显。Ratisoontor等[13]发现，在Saethre-Chotzen综合征患者中，TWIST1的缺失造成了颅缝细胞成骨矿化能力增加，TWIST1缺失可使得成骨细胞前体中的Periostin表达减少。目前，对于Periostin的研究主要集中在肿瘤方面，但对其在成骨方面研究近年来日益增加[15]，本研究初步研究了Periostin对颅缝细胞的作用。

综上所述，重组Periostin蛋白对TWIST1+/-小鼠冠状缝颅缝早闭的细胞增殖、分化具有抑制作用，并呈浓度依赖性：Periostin浓度为100 μg/L时，其抑制作用最明显；浓度为200 μg/L时，Periostin阻止颅缝细胞成骨分化的作用最显著。本结果使我们对TWIST1缺失导致的颅缝早闭的机理有了进一步认识，为Periostin蛋白应用于颅缝早闭的临床研究提供了依据，但作用机制及相关信号通路仍需深入研究。

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Effects of Recombinant Periostin on Proliferation and Osteogenic Differentiation of Cranial Suture Cells in TWIST1+/-Mouse

BAI Shanshan1,LI Junxian2,LI Dong1,XU Liang1,DUAN Huichuan1,YU Zheyuan1,YUAN Jie1,WE Min1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong Universit School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Shanxi 030012,China Corresponding author:YUAN Jie(E-mail:Jaman1@126.com);WEI Min(E-mail:drweimin@163.com).

Objective To observe the effects of recombinant Periostin on proliferation and osteogenic differentiation of cranial suture cells of coronal suture in TWIST1+/-mouse.Methods Cranial suture cells were separated and extracted from coronal suture of TWIST1+/-mouse.The cells were divided into 4 groups according to different concentration of recombinant Periostin:0 μg/L,50 μg/L,100 μg/L,200 μg/L group.CCK-8 method was used to detect the cell proliferation of cranial suture cells;Alkaline Phosphatase kit was used to detect the ALP activity;Real-Time PCR and Western Blot were used to detect the expression of osteogenic differentiation markers:OCN,OPN,BSP and COL-1.Results CCK-8 test showed that,compared with 0 μg/L group,other Periostin groups inhibited cranial suture cell proliferation in some degree (P＜0.05).ALP activity test showed that,after osteoinduction for 10 days,compared with 0 μg/L group,ALP activity of 50 μg/L,100 μg/L,200 μg/L Periostin groups were significantly decreased (P＜0.05).Real-Time PCR and Western Blot showed that,compared with 0 μg/L group,other groups significantly decreased the expression of OCN,OPN,BSP and COL-1(P＜0.05).Conclusion Different concentrations(50 μg/L,100 μg/L,200 μg/L)of recombinant Periostin can inhibit the proliferation and osteogenic differentiation of cranial suture cells of coronal suture in TWIST1+/-Mouse.

Periostin; Cranial suture cells;Osteogenic differentiation

国家自然科学基金（81471886）。

200011上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

袁捷 （E-mail：Jaman1@126.com）；韦 敏 （E-mail：drweimin@163.com）。

注：白珊珊，李俊宪为共同第一作者。

R622

A

1673－0364（2017）05－0283－04I y.

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.05.012

2017年7月25日；

2017年9月4日）