多糖碳点的制备及降血糖活性研究

(皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002)

·药学·

多糖碳点的制备及降血糖活性研究

王书生，邵太丽

(皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002)

目的：：研究牛蒡多糖碳点(CDs)的制备及降血糖活性。方法从牛蒡根中提取多糖(分子质量约4500 u)，以该多糖和枸橼酸为碳源，280℃下反应30 min为CDs，通过体外α-葡萄糖苷酶抑制试验，体内对高脂喂养联合链脲霉素诱导的糖尿病模型大鼠血糖水平试验研究其降血糖活性。结果体外抑制试验结果表明CDs浓度达到2.5 mg/mL时，抑制率达到89.24%;体内试验结果显示，糖尿病大鼠治疗42 d后，CDs组血糖为14.12 mmol /L，低于模型组的16.26 mmol /L。结论CDs具有较强的抑制葡萄糖苷酶活性，可降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，为进一步研究其体内降血糖机制奠定了基础。

碳点；α-葡萄糖苷酶抑制活性；降血糖活性

糖尿病(diabetes mellitus，DM) 是严重威胁人们健康的慢性疾病之一[1]。临床上降糖药物主要是化学药物，其效果好、见效快，但长期使用会产生抗药性和继发性失效，并伴随肝毒性、肾毒性及血糖波动频繁等不良反应，于是研究人员把目光投向了疗效好、毒性低的植物上[2]。牛蒡根含有多糖类物质，具有明显的降血糖等活性[3-7]，由于水提取多糖结构不唯一，因此大多数提取的多糖分子量虽然相当，但却没有活性。荧光碳量子点自2004年报道以来，以其抗光漂白，生物相容性好，水溶性好，易功能化等优势，在生物学及生物医学研究中显示出极大的应用潜力[8-11]。本研究从牛蒡根中提取纯化得到牛蒡多糖，牛蒡多糖和枸橼酸在高温下反应得碳点(carbon dots，CDs)，研究CDs体外抑制ɑ-葡萄糖苷酶活性，以及降低链脲霉素诱导的糖尿病模型大鼠的血糖水平活性，为进一步研究该CDs的体内降血糖活性提供基础。

1 材料

1.1 试剂 实验所用水为超纯水，试剂均为分析纯。4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside, PNPG)、α-葡萄糖苷酶(Sigma)、阿卡波糖(Acarbose)(Sigma)、链脲霉素( streptozoctoin，STZ) (Sigma)、枸橼酸(国药)、96孔可拆酶标版、透析袋MD45(1000)(上海易佰聚经贸有限公司)、0.22 μm微滤膜、D101吸附大孔树脂(深圳市宝安区硕科来实验设备销售中心)。

1.2 仪器 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，高速冷冻离心机(JW-3021 HR)，FD8-3冷冻干燥机(GOLD-SIM中国分公司)，DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱(金坛市荣华仪器制造有限公司)，聚四氟乙烯反应釜(芜湖市标科仪器销售部)，荧光酶标仪(深圳山特电子有限公司)，血糖仪及标配试纸(罗氏)，FA2014N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，艾科浦纯水机(颐洋企业发展有限公司)。

1.3 药材及动物 鲜牛蒡购自徐州丁氏百年食品有限公司，存放于皖南医学院中心实验室。180～200 g雄性SD大鼠40只(南京青龙山动物繁殖厂)。

2 方法和结果

2.1 牛蒡多糖的提取和分离 本课题组对牛蒡多糖的热水提取法进行了改造优化，其工艺流程如下：将鲜牛蒡洗净、去皮、切片，按照250 g/L料液比80℃水提取2次，第1次提取3 h，第2次提取2 h，合并两次提取液浓缩至一定体积，用3倍体积95%乙醇醇沉，4℃静置过夜。5000 r/min离心5 min获得沉淀，沉淀以水溶解并再次离心去除不溶物，取上清液浓缩到一定容量，采用Sevage法(氯仿∶正丁醇=4∶1，糖溶液∶Sevag试剂=4∶1，V/V)脱蛋白，直至交界面无变性蛋白为止，取上层水相溶液经旋转蒸发除去残留有机试剂，并经过D101吸附大孔树脂脱色，收集脱色溶液，经过0.22 μm微滤膜过滤除菌，采用截留分子质量为1000 u的透析袋4℃下流水透析48 h，将得到的溶液冷冻干燥得到牛蒡粗多糖成品。粗糖复溶后经过Sephadex G-100凝胶柱分离得到单一组份，采用高效液相色谱分析后认为是牛蒡多糖纯品(分子质量约4500 u)，与文献[12-13]报道相近。

2.2 CDs的制备及表征 称取牛蒡粗多糖和枸橼酸各1 g左右，置于内衬聚四氟乙烯反应釜中，加入10 mL蒸馏水，搅拌溶解。将反应釜放置于280℃干燥箱中反应30 min。反应结束后，将反应液倒出过滤，滤液经5000 r/min，4℃离心10 min，收集上清液。取上清液过0.22 μm滤膜两次，过滤后的上清液装入截留分子质量1000 u的即用型高精度RC透析袋中透析48 h，将得到的溶液冷冻干燥得CDs。称取微量冻干品，加蒸馏水溶解，在365 nm的紫外灯照射下，具蓝色荧光，如图1。

图中为荧光图，在紫外灯365 nm激发下。

图1 CDs的透射电镜图

2.3 CDs体外抑制α-葡萄糖苷酶的活性 参考文献[14-16]，以CDs为抑制剂、PNPG为底物，Acarbose作为阳性对照，检测对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。优化酶促反应后，得到最佳反应条件为：溶剂为pH 6.8 PBS缓冲液，Acarbose与CDs(0.078～2.5 mg/mL)分别与20 μL α-葡萄糖苷酶(1U/mL)混匀，37℃水浴10 min，加入底物PNPG(5 mmol/L)20 μL混匀，37℃水浴30 min后，加入0.2 mol/L Na2CO3100 μL终止反应。反应产物在405 nm处测定吸光度。反应分为空白对照组、CDs组、阳性对照组，每组均设置本底对照。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率(%)=[1-(AS-AC)/A0]×100%式中：AS为CDs或Acarbose反应组吸收度(CDs组或阳性对照组)，AC为各组自身本底对照吸收度；A0为等量 PBS 代替样品溶液的吸收度(空白对照组)。结果如表1所示，CDs浓度为2.5 mg/mL时，抑制率为89.24%，具有良好的抑制活性。

c/(mg/mL)Inhibitoryrate/%AcarboseCDs0．07822．12±10．70a2．31±1．18a0．15634．44±6．74ab12．38±3．36b0．31347．58±11．71bc34．41±2．94c0．62562．12±10．47cd64．88±9．38d1．25072．84±9．60de84．94±3．10e2．50082．67±4．49e89．24±1．67eF18．600203．837P0．0000．000

注：多组间两两比较，符号完全不同表示P<0.05。

2.4 CDs体内降血糖活性 参考文献[6-7], 大鼠适应性喂养1周，随机分成两组，空白组(Control)10只，给予普通饲料喂养。模型组30只，给予高脂饲料喂养。4周后，模型组禁食过夜，腹腔注射 STZ(35 mg /kg，STZ 溶于 0. 05 mol /L 柠檬酸缓冲液)。血糖稳定1周后，检测造模大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，以FBG>11.1 mmol /L为糖尿病模型建造成功。统计成模24只，随机等分成3组，每组8只, 分别为模型对照组(Model)、Acarbose组(200 mg /kg)、CDs组(200 mg /kg )。所有大鼠口服灌胃给药，每天1次，连续6周，给药治疗后每周剪尾采血，监测血糖，连续测6周。结果如表2，经过6周治疗后，CDs组与模型对照组对比血糖下降为14.12 mmol /L，低于模型组的16.26 mmol /L，其中Acarbose组血糖为13.41 mmol /L。初步表明CDs在体内具有一定的降血糖活性，其降低血糖的机制可能与抑制α-葡萄糖苷酶活性有关[6]。

GroupDose/(mg/kg)FBG/(mmol/L)0week6weekControl-5．04±0．42a4．85±0．45aModel-16．95±2．07b16．26±1．09bAcarbose20017．35±2．70b13．41±1．83bCDs20017．10±2．55b14．12±1．37cF64．279122．125P0．0000．000

注：多组间两两比较，符号不同表示P<0.05。

3 讨论

本文以牛蒡多糖和枸橼酸为碳源，高温反应得到荧光CDs，通过体外α-葡萄糖苷酶抑制试验来研究其降血糖活性，体外抑制试验结果表明CDs浓度达到2.5 mg/mL时，抑制率达89.24%以上，表明该CDs具有较强的葡萄糖苷酶抑制活性；体内试验在治疗42 d后，模型对照组血糖为16.26 mmol /L，高于CDs组血糖(14.12 mmol /L)，其中Acarbose组血糖为13.41 mmol /L，初步显示CDs能降低DM大鼠的血糖水平，为进一步研究其体内降血糖活性及机制奠定了基础。

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Preparationofthepolysaccharide-derivedcarbondotsanddeterminationofthehypoglycemicactivity

WANGShusheng,SHAOTaili

School of Pharmacy, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China

Objective：To determine the hypoglycemic activity ofArctiumlappaL. root polysaccharide-derived carbon dots(CDs).Methods: Polysaccharide(MW 4500) was extracted from the root of theArctiumlappaL. roots. CDs were prepared by pyrolyzation of the polysaccharide and citric acid under 280 ℃ for 0.5 h.Invitrotechnique was used to test ɑ-glycosidase enzyme inhibition and the hypoglycemic activity of CDs in the model rats of diabetic peripheral neuritis induced by streptozotocin.Results:Invitrotest indicated that the inhabitation activity of α-glycosidase was up to 89.24% at concentration of CDs being 2.5 mg/mL, and rats treated with CDs had lower blood glucose level than those in the model group(14.12 mmol /Lvs.16.26 mmol /L) after intragastric administration for 42 days.Conclusion: CDs has strong activity to inhibit α-glycosidase and capability to reduce blood glucose level of diabetic model rats. Our findings may lay a foundation for further investigation of the CDs in the mechanism of regulating the blood sugar.

carbon dots; α-glucosidase inhibitory activity; hypoglycemic activity

1002-0217(2017)06-0525-03

安徽省教育厅人才项目(gxfxZD2016157)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201510368012)

2017-04-11

王书生(1994-)，男，2013级药学专业本科生，(电话)0553-3932026，(电子信箱)1334260315@qq.com；

邵太丽，女，副教授，博士，(电子信箱) shaotl@mail.ahnu.edu.cn，通信作者。

R 285;R 284

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.06.004