胸膜转移性肺癌环状RNA表达谱及其临床意义

赵云峰 张明周 游雅婷 钱澜兰 郭亮 吴学玲

·论著·

胸膜转移性肺癌环状RNA表达谱及其临床意义

赵云峰1张明周2游雅婷2钱澜兰2郭亮2吴学玲3

目的探讨环状 RNA(circRNA)在胸膜转移性肺癌和胸膜结核表达谱中的差异。方法利用circRNA 芯片技术检测3例胸膜转移性肺癌和胸膜结核患者的表达谱，经过对原始数据进行预处理，均一化后，找出差异表达的circRNA，经qRT-PCR进行验证。根据表达差异倍数较高和样本间一致性较好的原则筛选circRNA，借助生物信息学软件预测可能受其调控的miRNA，结合文献检索初步确定可能在胸膜转移性肺癌中具有重要作用的circRNA。结果与胸膜结核比较，胸膜转移性肺癌中1.5倍以上变化，并且差异有统计学意义的circRNA定义为差异表达的circRNA。胸膜转移性肺癌中，1.5倍以上变化且P≤0.05的circRNA 共3条，其中上调2条，下调1条。分别为在胸膜转移性肺癌中明显上调的 hsa-circ-103212 (1.671倍，P=0.0245)、hsa-circ-104822 (1.514倍，P=0.0478)和明显下调的 hsa-circ-100548 (1.808倍，P=0.0287)。生物信息学分析和文献检索显示，hsa-miR-613和hsa-miR-24-3p可能受 hsa-circRNA-104822的调控而影响肺癌的发生、发展和转移。结论与胸膜结核比较，胸膜转移性肺癌 circRNA 表达谱发生了显著变化；hsa-circRNA-104822可能在肺癌 、发展和转移中起重要作用。

环状RNA； miRNA； 肺癌； 转移

环状RNA又称环形RNA(circular RNA, circRNA)，是一种具有环状结构的长链非编码RNA。 circRNA的特点及功能近来才真正被揭示，并且极大程度上改变了人们对circRNA在肿瘤发生发展中作用的看法 。到目前为止，研究者们发现了两种主要的circRNA，内含子及外显子circRNA，功能众多。迄今，许多研究阐述了circRNA的特殊作用[1-3]。其中，circRNA在肿瘤发生及恶性生物学性能中的microRNA海绵作用带给人们对肿瘤发生发展分子机制的全新认识。 circRNA是否在肺癌的发生发展和转移中发挥作用，目前尚不明确。 本研究探索胸膜转移性肺癌中circRNA的表达谱，为circRNA在肺癌转移中的作用提供依据。

材料与方法

一、实验材料

3例胸膜转移性肺癌组织标本来源于2014年1月至2014年12月在第三军医大学新桥医院呼吸科经内科胸腔镜获得组织的患者，3例对照标本为来自同一时间段内经胸腔镜诊断的胸膜结核患者。标本取出后立即放入-80 ℃冰箱保存。 转移性肺癌和胸膜结核组织均经病理证实。

二、研究方法

总RNA提取: 从-80 ℃冰箱保存至提取总RNA。取100 mg标本，应用RNA抽 提试剂TRIzol (Invitrogen公司) 按照试剂说明 分别从胸膜转移性肺癌组织和胸膜结核组织中提取总RNA，应用 NanoDrop ND1000进行纯度和浓度测定；RNA 标记:应用RNase R(Epicentre公司)处理总 RNA，去除线性RNA，富集circRNA，应用随机 引物按照Arraystar Supper RNA Labeling Protocol 对circRNA进行扩增并转录为荧光cRNA；芯片杂交:将荧光标记的cRNA应用RNA提取试剂盒 (Qiagen公司)纯化后在circRNA芯片(8×15 K，Arraystar公司)上杂交，于分子杂交仪 (Agilent 公司) 65 ℃孵育17 h；芯片扫描：杂交后的芯片洗片后，应用Agilent Scanner G2505C扫描。

三、生物信息学分析

根据差异表达变化倍数筛选circRNA，应用Arraystar的miRNA目标预测软件(一款基于TargetScan和miRNA的软件)预测与之相互作用的miRNA，文献检索已经证实的在肿瘤发生发展中具有重要作用的miRNA，初步确定在胸膜转移性肺癌中具有重要作用的circRNA[4-5]。

四、统计学方法

将芯片扫描图片导入Agilent Feature Extraction软件(版本11.0.1.1)提取原始数据；应用R软件包对原始数据进行标准化并进行分析，两组样本间差异表达的circRNA 通过变化倍数进行筛选，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、识别差异表达的circRNA

与胸膜结核比较，胸膜转移性肺癌组织中的circRNA表达谱发生了明显变化，见图1。图1左侧/右侧红点分别表示在胸膜转移性肺癌中表达下调/上调的满足差异倍数1.5倍以上且具有统计学意义的circRNA，P<0.05。

图1 circRNA 火山图

二、聚类分析circRNA表达谱的差异

绘制circRNA聚类图，结果显示在胸膜转移性肺癌和胸膜结核组织样本间circRNA的表达谱存在差异，见图2。

图2 差异circRNA聚类图

三、胸膜转移性肺癌中差异表达circRNA的筛选

将差异表达1.5倍以上且P<0.05的circRNA 确定为差异表达的circRNA。结果显示，胸膜转移性肺癌组织和胸膜结核相比，1.5倍以上变化的circRNA共3条，其中上调的共2条，下调的共1条，分别为在胸膜转移性肺癌组织中明显上调的 hsa-circ-103 212 (1.671倍，P=0.0245)、hsa-circ-104 822 (1.514倍，P=0.0478) 和明显下调的 hsa-circ-100 548 (1.808倍，P=0.0287)，见表1。

表1 差异表达的circRNA

四、可能与circRNA相互作用的miRNA

应用Arraystar的miRNA目标预测软件对差异表达变化倍数较高的circRNA进行分析，得到可能与之相互作用的miRNA。通过文献检索发现，hsa-miR-24-3p可能跟肺癌胸膜转移相关[6]，见表2。

表2 Arraystar预测的可能与circRNA相互作用的miRNA

讨 论

迄今为止，人类已充分认识到miRNA在抑癌或致癌过程中具有重要作用[7]，然而对circRNA在肿瘤中的调控机制却知之甚少。同其他长链非编码RNA等转录物一样，circRNA可竞争性结合miRNA，下调表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor, EGFR) 、胰岛素受体底物1 (insulin receptor substrate-1, IRS-1) 、P53及癌基因Raf1 等重要致癌因子的表达[8-11]，因而在前列腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、肝癌等多种肿瘤发生发展中发挥着重要作用[12]。但目前关于circRNA在肺癌中的表达和作用机制研究甚少[13]。

近期发现的一个circRNA名为小脑变性相关蛋白 1反义转录物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript, CDR1as) ，也称为ciRS-7 ，在人脑组织中表达丰富，在其序列上有超过70个多个串联的微小RNA-7( microRNA-7, miR-7) 结合位点，起到miR-7的海绵作用，故而调控miR-7靶标基因活性[14-15]。研究发现miR-7可通过调控细胞凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，BCL-2) 的表达来抑制人非小细胞肺癌A549细胞的生长[16]；而抑制miR-7可抑制肺癌肿瘤细胞细胞株的增殖并促进其凋亡；在肺癌95D细胞中，TLR9激动剂CpG ODNs可通过诱导HuR的表达来抑制miR-7的表达，促进肿瘤的生长及转移。因此推测ciRS-7对miR-7的调控作用可能在肺癌的发生发展中起重要作用。

因此研究肺癌组织中circRNA的表达谱，将为其后继功能研究打下基础。本研究采用Arraystar公司推出的全球首款circRNA芯片，采用特异性剪接位点探针与外切酶预处理双重保障，能够准确检测样本中circRNA的表达。借助芯片对胸膜转移性肺癌和胸膜结核组织的RNA进行分析，获得了胸膜转移性肺癌和胸膜结核的circRNA表达谱。按照差异表达倍数 ≥1.5且P<0.05进行筛选， 这3条具有统计学意义的差异表达的circRNA 在3对样本中具有较好的一致性。通过生物信息学软件预测出这3条circRNA可能结合的 miRNA后，综合推测， hsa-miR-613可能与肺癌的发生发展有关，hsa-miR-24-3p可能与肺癌的转移有关[17-18]。而hsa-circ-104 822可能与 hsa-miR-613及hsa-miR-24-3p发生结合，因此推测hsa-circ-104 822可能与肺癌的发生、发展及转移相关。

本研究的局限性在于实验采用的芯片为Human Circlar RNA Array V1.0，有许多新近发现的circRNA未纳入研究中；通过生物信息学预测和文献检索确定的hsa-circ-104822 尚未进行实验验证。本研究组下一步将继续进行该circRNA的Qrt-PCR进行确认，并进行功能实验。

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DifferentiallyexpressedcircularRNAsinhumanpleuralmetastaticlungcancerandclinicalsignificance

ZhaoYunfeng1,ZhangMingzhou2,YouYating2,QianLanlan2,GuoLiang2,WuXueling3.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,PunanHospital,Shanghai200125,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037China;3DepartmentofRespiratoryMedicine,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025China

WuXueling,Email:wu261912@126.com

ObjectiveTo analyze the difference of circular RNA (circRNA) expression profiles between pleural metastatic lung cancer and pleural tuberculosis.MethodsThe circRNA expression profiles in 3 paired specimens of pleural metastatic lung cancer and pleural tuberculosis were detected using the human circRNA microarray. After preprocessing and homogenization of the original data, the differentially expressed circRNAs were searched out. The circRNA in pleural metastatic lung cancer showed a greater than 1.5-fold andP≤0.05 compared with pleural tuberculosis was regarded as differentially expressed circRNA and then confirmed by qRT-PCR. After these circRNAs screening according to the principle of higher fold change and better consistency and their putatively targeting miRNAs prediction by bioinformatics software combined with literature review, the circRNAs that potentially contribute to lung cancer development and metastasis were preliminarily identified.ResultsThe circRNA expression profile in pleural metastatic lung cancer showed remarkable changes compared with pleural tuberculosis. In pleural metastatic lung cancer, a total of 3 circRNAs showed a greater than 1.5-fold change, and of them, 2 were up- regulated and 1 were down-regulated. The significantly up-regulated circRNA hsa-circ-103 212 (1.671 fold,P=0.0245) and hsa-circ-104 822(1.514 fold,P=0.0478), and significantly down-regulated circRNA hsa- circ-100548 (1.808 fold,P=0.0287) were obtained after screening. Bioinformatics analysis and literature review suggested that hsa-miR-613 and hsa-miR-24-3p was potentially regulated by hsa-circ-104 822 which contributed to the metastasis and development of lung cancer.ConclusionThe circRNA expression profile in pleural metastasis lung cancer is greatly changed. hsa-circ-104 822 may play important roles in the metastasis and development of lung cancer.

Circular RNA; miRNA; Lung cancer; Metastasis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.06.009

上海市卫生和计划生育委员会课题(201640377)

上海市浦东新区卫生系统重点专科培养计划资助(PWZ zk2017-18)

200125 上海，上海市浦东新区浦南医院呼吸内科1

400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸内科2

200025 上海，上海交通大学医学院仁济医院呼吸内科3

吴学玲， Email: wu261912@126.com

R563

A

2017-04-21)

张大春)

赵云峰，张明周，游雅婷，等. 胸膜转移性肺癌环状RNA表达谱及其临床意义[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(6)： 677-680.