补体C3d-p28对阿尔茨海默病DNA疫苗的免疫增强作用

郭婉姝 史宝和 王楠 陈晓虹

补体C3d-p28对阿尔茨海默病DNA疫苗的免疫增强作用

郭婉姝 史宝和 王楠 陈晓虹

目的探讨补体C3d-p28作为分子佐剂，在阿尔茨海默病DNA疫苗基因免疫中的作用。方法在第1、8、22、43、64、85、106、127天，将重组质粒p(Aβ3-10)10、p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)肌肉注射于APP/PS1双转基因鼠后腿股四头肌内。疫苗接种前、自第2次注射开始每次接种后7天取鼠眶静脉血共8次，以ELISA法检测抗Aβ抗体的滴度和分型；第8次(最后1次)眶静脉取血后进行6 d的Morris水迷宫实验，通过定位航行和空间探索实验评估小鼠空间学习记忆能力。水迷宫实验结束后处死小鼠，以ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液中白细胞介素4(IL-4)和 干扰素γ(IFN-γ)水平，免疫组化染色法检测小鼠脑内Aβ斑的表达。结果p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组抗Aβ抗体水平高于p(Aβ3-10)10组〔(55.03±8.93)μg/mLvs.(27.32±7.69)μg/mL，t=-4.455，P<0.05〕，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组抗体类型主要是IgG1型〔(50.64±6.96)μg/mL〕，明显高于p(Aβ3-10)10组〔(14.15±3.16)μg/mL，P<0.05〕。与p(Aβ3-10)10组比较，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组Morris水迷宫实验平均逃避潜伏期变短、穿越平台次数和穿越平台所在象限停留的时间比例明显增多(均P<0.05)；脾细胞培养上清液中IL-4水平增高〔(110.22±18.12)pg/mLvs.(170.12±22.16)pg/mL，P<0.05〕、IFN-γ水平减低〔(800.12±80.11)pg/mLvs.(640.12±70.53) pg/mL，F=6.152，P<0.05〕；脑内沉积的Aβ斑块明显减少(P<0.05)。结论补体C3d-p28分子佐剂使p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3抗Aβ抗体的产生增加、Th2型免疫反应增强，转基因鼠空间学习记忆能力提高。

阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白；DNA疫苗；C3d-p28分子佐剂； APP/PS1双转基因鼠

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)是一种神经系统变性疾病，其典型病理特征为细胞外老年斑(SP)和细胞内神经元纤维缠结(NFTs)的形成。Aβ免疫治疗可阻止Aβ产生、聚集和/或增加Aβ清除，被认为是治疗AD的有效治疗策略。作为安全、有效的Aβ主动免疫疫苗，不仅应具有治疗作用的抗Aβ抗体，避免Th1型细胞免疫反应，同时还需要具有减缓认知功能减退的作用。现有研究表明，C3d分子佐剂通过与B细胞表面的补体受体2(CR2)结合，诱发强烈的体液免疫反应[1]，可将免疫应答模式由Th1型向Th2型转变[2]。而p28分子是补体C3d分子与CR2特异性结合的结合域，p28分子与全长C3d分子有相似的佐剂性质[3]，但p28分子大小仅占C3d分子全长的9%[4]，这将更增强了DNA疫苗的有效利用。据此，本文作者设计了一个新的质粒DNA疫苗p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3，该疫苗中加入了鼠补体C3d-p28分子佐剂来增强p(Aβ3-10)10抗原的免疫原性。

本次试验中以重组质粒疫苗p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫APP/PS1双转基因鼠进行研究，评价补体C3d-p28作为分子佐剂，能否增强疫苗的有效性和安全性，以及其能否增强疫苗对认知功能的影响。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1主要动物：12月龄雌性APP/PS1双转基因鼠21只，体质量(30±2)g，购于中国医科大学实验动物研究中心，并在SPF(specific pathogen free)级环境下饲养。

1.1.2主要试剂：重组质粒疫苗p(Aβ3-10)10和p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3由湖南长沙赢润生物技术有限公司合成；抗Aβ抗体6E10(Signet，美国)；羊抗鼠IgG1-HRP、羊抗鼠IgG2a-HRP、羊抗鼠IgG2b-HRP(Zymed，美国)；小鼠白细胞介素-4(IL-4)ELISA试剂盒、小鼠干扰素γ(IFN-γ) ELISA试剂盒(Bender Med Systems GmbH，奥地利)。

1.2方法

1.2.1分组：APP/PS1双转基因鼠21只，按随机数字表法分成重组质粒p(Aβ3-10)10组、重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组、空载体pcDNA3.1(+)组 3组，每组7只。

1.2.2免疫方法：于小鼠左后腿股四头肌肌肉注射疫苗抗原： 重组质粒p(Aβ3-10)10、重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)，每只鼠注射100 μL(1.0 μg/μL)。3组小鼠按第1、8、22、43、64、85、106、127天免疫，共免疫8次。

1.2.3检测血清抗Aβ抗体滴度及分型：疫苗接种前、自第2次注射开始每次接种后7天取鼠眶静脉血共8次，每次0.5 mL，应用ELISA法检测血清中抗Aβ抗体滴度及各分型(IgG1、IgG2a和IgG2b)的滴度[5]。

1.2.4Morris 水迷宫检测鼠的空间学习记忆功能：(1)定位航行实验：于第8次(最后1次)眶静脉取血后进行水迷宫实验。第1～2天进行可视平台训练。每天训练4次，分上、下午两个时段，池壁标明东、南、西、北四个入水点，水池等分为四个象限，将小鼠面向池壁，分别从4个入水点放入水中，记录小鼠从入水到找到平台并站立其上所需的时间，即逃避潜伏期(escape latency)。第3～5天进行隐藏平台训练。将平台隐藏于水下1 cm，实验方法同上。

(2)空间探索实验：实验第6天，撤去平台，选择平台相对象限的入水点，将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠穿越平台的次数和穿越平台所在象限停留的时间比例。

1.2.5检测脾细胞培养上清液中细胞因子的水平：水迷宫实验结束后，3组小鼠经10%(0.03 mg/kg)水合氯醛腹腔麻醉后处死，其中每组取2只小鼠的脾脏用于细胞培养。ELISA试剂盒检测脾脏细胞因子IL-4和IFN-γ水平。

1.2.6检测脑内Aβ斑的表达：其余5只小鼠被剪开右心耳，从左心室快速灌注生理盐水100 mL，迅速分离出大脑(剪开颅盖骨)，以4%(质量浓度)多聚甲醛缓冲液固定，常规制备石蜡切片，厚度约4 μm，每只小鼠取大致相同位置3张切片。应用免疫组织化学染色方法检测脑内Aβ斑的表达[9]。一抗：1︰1000稀释的6E10。结果判断：以棕色/棕褐色、颗粒状斑块结构为Aβ斑。Image J图像分析软件进行Aβ斑面积的定量分析。测定海马区或皮质区的总面积和相应的Aβ斑面积，计算海马区或皮质区Aβ斑面积百分比。

1.3统计学处理用统计软件SPSS17.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析。实验数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，组间两两比较采用LSD法；抗Aβ抗体滴度的比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清抗Aβ抗体滴度及分型的检测经p(Aβ3-10)10和p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫的小鼠均产生了抗Aβ抗体，并且在第2次免疫后血清抗Aβ抗体的滴度平稳增长，与p(Aβ3-10)10组比较，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组抗Aβ抗体滴度明显增高(P<0.05)，pcDNA3.1(+)组免疫的小鼠未检测出抗Aβ抗体(表1)。与p(Aβ3-10)10组抗IgG1 抗体滴度比较，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组滴度明显增高〔(14.15±3.16)μg/mLvs.(50.64±6.96)μg/mL，t=12.177，P=0.000〕，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组IgG2a和IgG2b滴度低于p(Aβ3-10)10组〔IgG2a滴度分别为(5.27±1.18)μg/mLvs.(7.35±1.60)μg/mL，t=-2.302，P=0.040；IgG2b滴度分别为(7.89±2.43)μg/mLvs.(13.12±4.56)μg/mL，t=2.909，P=0.044〕，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组IgG1/IgG2a的比值明显高于p(Aβ3-10)10组(9.77±0.68vs.1.94±0.11，t=19.688，P=0.000)。

2.2免疫小鼠空间学习记忆功能的检测第1-2天的可视平台训练中，3组小鼠平均逃避潜伏期差异无统计学意义。第3-5天的隐藏平台定位航行实验中，3组小鼠平均逃避潜伏期呈逐渐下降的趋势，与p(Aβ3-10)10组和pcDNA3.1(+)组比较，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组平均逃避潜伏期明显减低(P<0.05，表2)。在第6天空间探索实验中，与其他2组比较，1 min内，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组在平台所在象限停留的时间和穿越平台的次数均增高(P<0.05，表2)。

2.3脾细胞培养上清液中细胞因子水平比较与 p(Aβ3-10)10组和pcDNA3.1(+)组比较， p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组IL-4水平明显增高(P<0.05，表3)，而前2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组和pcDNA3.1(+)组IFN-γ水平均低于p(Aβ3-10)10组(P<0.05，表3)，而前2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 接种后各组APP/PS1双转基因鼠不同时间点抗Aβ抗体的滴度比较 (n=7 ，±s，μg/mL)

注：与p(Aβ3-10)10 组比较，*P<0.05；表中时间点按取眶血次数为计

注：与p(Aβ3-10)10组 比较，*P<0.05;与pcDNA3.1(+)组比较，#P<0.05

表3 三组大鼠脾细胞培养上清液中细胞因子水平及皮质、海马区AB斑面积比较 (n=7，±s，)

注：与p(Aβ3-10)10组比较，*P<0.05；与pcDNA3.1(+)组比较，#P<0.05

2.4三组大鼠脑内Aβ斑比较3组小鼠皮质和海马均可见Aβ斑，与p(Aβ3-10)10组和pcDNA3.1(+)组比较， p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组Aβ斑的数量明显减少(图1)。p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组皮质和海马Aβ斑面积与p(Aβ3-10)10组和pcDNA3.1(+)组比较明显减少，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组皮质的Aβ斑数量较p(Aβ3-10)10组减少39.0%，海马的Aβ斑数量较p(Aβ3-10)10组减少36.0%(均P<0.05，表3)。

3 讨论

本研究中发现融入了补体C3d-p28的重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3疫苗免疫12月龄APP/PS1双转基因鼠产生了有效的、安全的作用，没有产生不良的Th1型细胞免疫反应，同时还减缓了认知功能的减退。

从疫苗的有效性角度来看，现有研究已表明编码不同抗原基因(西尼罗病毒、乙肝病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒、疟原虫环孢子蛋白)的DNA疫苗在融合了补体C3d-p28分子佐剂后，抗原的免疫原性大大地增强了，DNA疫苗的有效性也大大提高[5]。本次试验，第2次免疫后，重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫的小鼠产生了较高滴度的抗Aβ抗体，抗体滴度明显高于p(Aβ3-10)10组，并且脑内Aβ斑定量分析显示重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫的小鼠脑皮质和海马沉积的Aβ斑较p(Aβ3-10)10组明显减少。脑内Aβ斑块沉积是AD诊断的决定性指标，临床通常以其清除效果用来评价AD模型鼠的疗效。本研究结果显示融入了补体C3d-p28的Aβ3-10疫苗产生了足够的抗Aβ抗体水平，而且所产生的抗Aβ抗体既能穿透血脑屏障，又能与脑内Aβ斑特异性结合而清除Aβ斑块，这与抗Aβ 6E10抗体产生了相似的治疗作用；脑内Aβ斑较p(Aβ3-10)10组明显减少，表明补体C3d-p28分子佐剂增强了Aβ3-10疫苗的免疫原性。

从疫苗的安全性来分析，现有研究业已证实，Th2型免疫反应主要诱导IgG1抗体，通过产生IL-4，IL-5等细胞因子增强体液免疫反应；Th1型免疫反应主要产生IgG2a抗体，通过产生IFN-γ，IL-2等细胞因子诱导细胞介导的炎性反应，如AN1792临床试验中出现了Th1型免疫反应诱发的脑膜脑炎[6-7]，前者是本研究所需要的，后者正是本研究实验中所要避免的。本研究中，重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫小鼠产生了以IgG1为主的抗体，而p(Aβ3-10)10组则产生了Th1/ Th2混合型的免疫反应；并且p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组IgG1/IgG2a的比值明显高于p(Aβ3-10)10组。上述情况表明融入了补体C3d-p28的Aβ3-10疫苗产生了倾向于Th2型的免疫反应。重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组脾细胞培养上清液中的IL-4水平高、IFN-γ水平低，而p(Aβ3-10)10组IL-4水平低和IFN-γ水平高。细胞因子的检测结果再次说明了融入了补体C3d-p28的Aβ3-10疫苗产生了Th2型免疫反应，这样就降低了发生炎性反应的可能性。

从水迷宫试验数据分析，重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组的平均逃避潜伏期明显短于p(Aβ3-10)10组和pcDNA3.1(+)组。在探索试验中，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组穿越平台次数和穿越平台所在象限停留的时间比例均高于p(Aβ3-10)10组和pcDNA3.1(+)组，表明重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组与p(Aβ3-10)10组和pcDNA3.1(+)组比较小鼠的空间学习记忆能力明显改善。因此，融入了补体C3d-p28的Aβ疫苗免疫小鼠可增强该疫苗改善认知的能力。

综上所述，融入了补体C3d-p28的重组质粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫APP/PS1双转基因鼠后，不仅仅能够增强抗原的免疫原性，增强诱发Th2型免疫反应的能力，还能够增强改善小鼠空间学习记忆的功能。

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ImmunoenhancementofcomplementC3d-p28onAlzheimer’sdiseaseDNAvaccine

GUOWanshu，SHIBaohe，WANGNan，CHENXiao-hong

DepartmentofNeurology，ThePeople’sHospitalofChinaMedicalUniversity，ThePeople’sHospitalofLiaoningProvince，ShenyangLiaoning110016，China

CHEN Xiaohong，Email： cxh_ly@163.com

ObjectiveTo discuss the effect of complement C3d-p28 in the genetic immunization of Alzheimer’s disease DNA vaccine.MethodsOn day 1，8，22，43，64，85，106，127， the recombinant plasmid p(Aβ3-10)10， recombinant plasmid p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 and pcDNA3.1(+)were injected intramuscularly into the musculi quadriceps femoris of APP/PS1 double transgenic mouse hind leg. Before the vaccination and 7 days after the second injection， the orbital vein blood was taken 8 times. ELISA was used to detect the titer of serum anti-Aβ antibody， isotypes of immunoglobulin. After the eighth orbital vein blood collection， Morris water maze test was conducted to evaluate the spatial learning and memory ability of the mice through the positioning navigation and space exploration tests for 6 days. The mice were killed at the end of the water maze test， and the contents of IL-4 and IFN-γ in the supernatant of spleen cell culture were detected by ELISA. The β-amyloid plaques in mouse brains were detected by immunohistochemistry.ResultsThe titers of anti-Aβ antibodies in the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group were higher than those in the p(Aβ3-10)10 group [(55.03±8.93)μg/mLvs.(27.32±7.69)μg/mL，t=-4.455，P<0.05]. The type of antibody in the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group was mainly IgG1 type[(50.64±6.96)μg/mL]，apparently higher than p(Aβ3-10)10 group[(14.15±3.16)μg/mL，P<0.05].In the Morris water maze， the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group showed shorter escape latency and spent significant more time in the target quadrant and crossed the platform significantly more often than p(Aβ3-10)10 immunized mice. In the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group， the content of IL-4 in the supernatant of spleen cell culture was higher [(170.12±22.16) pg/mL，P<0.05]， the content of IFN-γ was lower[(640.12±70.53) pg/mL，F=6.152，P<0.05]， and the deposition of amyloid burden in hippocampal and cortex was significantly reduced (P<0.05),compared with the p(Aβ3-10)10 group.ConclusionsComplement C3d-p28 molecular adjuvant enhanced the production of anti Aβ antibody of recombinant plasmid p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3，enhanced the Th2 type immune response， and improved the spatial learning and memory ability of transgenic mice

Alzheimer’s disease; Amyloid-β; DNA vaccine; C3d-p28 molecular adjuvant; APP/PS1 transgenic mice

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.06.005

辽宁省博士启动基金(2016011039-301)

110016 辽宁省人民医院 中国医科大学人民医院神经内科

陈晓虹，Email：cxh_ly@163.com

R741.05

A

1006-2963(2017)06-0401-05

2017-02-08)

邹晨双)