核转录因子κB涉及水通道蛋白-4抗体阳性血清对星形胶质细胞的毒性作用

李晓晖 李艳 曹晓芸 任士卿

核转录因子κB涉及水通道蛋白-4抗体阳性血清对星形胶质细胞的毒性作用

李晓晖 李艳 曹晓芸 任士卿

目的探讨核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)在水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)抗体诱导的星形胶质细胞损伤中的作用。方法纯化培养新生SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞，按随机数字表法分为对照组、吡咯醛二硫氨基甲酸(PDTC)组、AQP4抗体阳性血清组(AQP4抗体组)和AQP4抗体+PDTC组，其中对照组加入10%(体积分数)健康人血清，PDTC组给予10 μmol/L PDTC预处理1 h后加入等量健康人血清；抗体组加入AQP4抗体阳性血清；AQP4抗体+PDTC组先用PDTC预处理1 h后再加入AQP4抗体阳性血清。细胞培养12 h后采用免疫细胞化学荧光法观察各组NF-κB p65入核情况，MTS比色法检测细胞存活度，免疫印迹法检测细胞内p65蛋白、磷酸化p65(p-p65)蛋白的表达。结果AQP4抗体组可见明显NF-κB p65入核，其余三组均未见明显入核；AQP4抗体+PDTC组细胞存活度高于AQP4抗体组(吸光度值分别为0.4380±0.005、0.3897±0.045，F=133.355，P<0.05)；各组间NF-κB p65蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；AQP4抗体+PDTC组p-p65蛋白表达水平较AQP4抗体组明显减少(分别为0.7027±0.020，0.8197±0.027，F=10.794，P<0.05)。结论AQP4抗体阳性血清可能通过激活NF-κB途径促进星形胶质细胞损伤，抑制NF-κB活性对星形胶质细胞具有保护作用。

视神经脊髓炎谱系疾病；水通道蛋白-4；星形胶质细胞；核转录因子κB

视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorder， NMOSD)是一组主要累及视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，主要表现为反复发作的视神经炎和长脊髓节段横贯性脊髓炎，是一种致残率高、预后较差的临床综合征[1]。迄今为止尚无特效的治疗方法。因此，探讨其发病机制，寻找有效的治疗靶点具有重要的临床意义。目前认为，抗水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)抗体和星形胶质细胞终足膜上AQP4结合引发补体依赖性细胞毒性导致星形胶质细胞损伤和死亡，募集炎性细胞和细胞因子发生炎性反应以及血脑屏障破坏是疾病发生发展的主要机制[2]。

核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)在调节免疫和炎性反应中发挥重要作用[3]。研究表明补体失活的AQP4抗体阳性血清能激活星形胶质细胞NF-κB信号通路，导致中性粒细胞募集和炎性因子释放，认为激活星形胶质细胞NF-κB信号通路是AQP4抗体和AQP4结合后的早期事件[4]。但NF-κB在AQP4抗体诱导的星形胶质细胞损伤中的作用尚未见研究报道。本研究使用纯化培养的大鼠皮层星形胶质细胞，通过观察NF-κB抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamic acid，PDTC)对暴露于AQP4抗体阳性血清的星形胶质细胞存活度的影响以及星形胶质细胞p65、磷酸化p65(p-p65)的蛋白表达水平，探讨NF-κB在AQP4抗体阳性血清对星形胶质细胞细胞毒性中的作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物：新生48 h内SD大鼠24只，由河北医科大学实验动物中心提供(合格证编号1410028)。

1.1.2主要试剂：DMEM/F12购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国BioInd公司，PDTC购自碧云天公司，CellTiter 96单溶液细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司，抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体购自美国Millipore公司，兔抗NF-κB p65抗体购自英国abcam公司，兔抗NF-κB p-p65抗体购自美国CST公司，DyLight488羊抗鼠IgG二抗和DyLight594羊抗兔IgG二抗购自美国Sigma公司，DyLight800羊抗兔IgG二抗购自美国Abbkine公司。

1.1.3血清来源：河北医科大学第三医院神经内科就诊的符合Wingerchuck诊断标准[5]的NMOSD患者中选取使用德国欧蒙公司AQP4抗体测定试剂盒测定AQP4抗体阳性的3例患者，其抗体强度分别为++、+++和+++，并均不伴发其他自身免疫性疾病且核抗原抗体阴性。其混合血清作为AQP4抗体阳性血清用于实验。健康人血清取自同龄健康查体者。取早晨空腹静脉血，高速离心机离心3 min(离心加速度356g)，血清分装后置-80℃冰箱备用。该研究得到河北医科大学第三医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1新生SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养：取出生48 h内的SD大鼠大脑皮层，解剖镜下剥除软脑膜和血管，剪碎后经0.25%(质量浓度)胰蛋白酶消化15 min，再加入含20%(体积分数) 胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，吸管吹打，200目细胞筛过滤，1000g离心5 min，加培养基制备成单细胞悬液。将细胞接种于玻璃皿中，置37℃ 5%(体积分数) CO2细胞培养箱内孵育30 min后，吸取瓶中的细胞悬液，以1×105个/cm2接种密度接种到预先涂有多聚左旋赖氨酸的培养皿中培养，24 h 后换液，以后3 d 换液1次。继续培养10 d，待细胞铺满培养皿时，置于37℃摇床中振荡、清洗以及胰蛋白酶消化处理后，倒置显微镜下观察细胞形态变圆后加入完全培养基终止消化。重复传代培养3次后即可得到纯化的星形胶质细胞。采用免疫细胞化学GFAP染色鉴定星形胶质细胞，细胞纯度达到95%以上，用于下述实验。

1.2.2实验分组：将相同批次细胞按随机数字表法分为对照组、PDTC组、AQP4抗体组和AQP4抗体+PDTC组。其中对照组加入10%(体积分数)健康人血清；PDTC组先给予10 μmol/L PDTC预处理1 h后加入等量健康人血清；AQP4抗体组加入等量AQP4抗体阳性血清；AQP4抗体+PDTC组先给予PDTC预处理1 h后加入等量AQP4抗体阳性血清。以下每组实验均重复进行3次。

1.2.3免疫细胞化学荧光法观察各组NF-κB p65入核情况：待染细胞去除培养液，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，40 g/L 多聚甲醛固定30 min，0.2%(体积分数)Triton X-100透化5 min，山羊血清封闭45 min后加抗兔抗NF-κB p65抗体(1∶200)和DyLight 594羊抗兔IgG(1∶200)孵育，DAPI标染细胞核，正置荧光显微镜下摄片，观察各实验组NFκB p65入核情况。被抗体封闭后的NF-κB p65在荧光显微镜下呈红色， NFκB p65入核的细胞核呈红色，无NFκB p65入核的细胞核呈蓝色。

1.2.4MTS比色法检测各实验组活细胞数量：严格按照试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度值〔D(λ)〕，根据D(λ)值判定活细胞数量，活细胞数量多者D(λ)值增高。

1.2.5Western blotting法测定各组NF-κB p65及p-p65蛋白表达水平：培养细胞弃上清，PBS洗涤后分别加入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液，用细胞刮刀刮下细胞，4℃以14000g离心20 min，取上清用BCA 法对蛋白进行定量。蛋白变性后，经SDS-PAGE电泳，用半干转膜法印记于PVDF膜，用5%(质量浓度)脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗NF-κB p65抗体、兔抗NF-κB p-p65抗体、β-Actin抗体4℃孵育过夜，次日用TBST 洗涤后加入相应的二抗，室温孵育1 h，洗去未结合的二抗后上机读取。用Western blot 印迹分析软件计算各条带光密度值，分析蛋白表达情况。

1.3统计学处理采用SPSS21.0软件进行分析。所有数据均以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间差异有统计学意义者应用SNK行组间多重比较检验。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组星形胶质细胞NF-κB入核情况比较对照组、PDTC组均未见明显NF-κB p65入核细胞，AQP4抗体组可见大量NF-κB p65入核，AQP4抗体+PDTC组也未见明显p65进入细胞核。结果见图1。

2.2各组星形胶质细胞存活度比较对照组和PDTC组细胞存活度无明显差异(P>0.05)；AQP4抗体组细胞存活度较对照组明显降低(P<0.05)，而AQP4抗体+PDTC组存活细胞较AQP4抗体组明显增多(P<0.05)，但仍低于对照组水平(P<0.05)。结果见表1。

上排图为NFκB p65(红色)；下排图为NFκB p65与细胞核(蓝色)merge后，无NFκB p65入核的细胞核呈蓝色，有NFκB p65入核的细胞核呈红色 图 1 各组星形胶质细胞NF-κB p65入核情况比较(免疫荧光染色)

组别细胞存活度NFκBp65p⁃p65蛋白AQP4抗体+PDTC组04380±0005∗#07093±004407027±0020#AQP4抗体组03897±0045∗07821±005908197±0027∗PDTC组05387±001407880±004707279±0020对照组05411±001708029±004507439±0032F值133355215910794P值000001710003

注：*与对照组比较，P<0.05；#与AQP4抗体组比较，P<0.05

2.3各组星形胶质细胞NF-κBp65磷酸化情况比较对照组、PDTC组、AQP4抗体组和AQP4抗体+PDTC组NF-κB p65表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；而AQP4抗体组p-p65蛋白表达水平明显高于其他三组(P<0.05)。结果见表1和图2。

1：对照组；2：PDTC组；3：AQP4抗体组；4：AQP4抗体+PDTC组 图 2 各组星形胶质细胞NF-κB p65和p-p65蛋白表达(western blot法)

3 讨论

AQP4抗体不仅是NMOSD的特异性标志物，而且在NMOSD发病机制中发挥重要作用。AQP4抗体和星形胶质细胞膜表面上的AQP4结合导致星形胶质细胞损伤，激发炎性反应并破坏血脑屏障，继发性引起少突胶质细胞损害和神经元死亡是其主要的发病机制。星形胶质细胞死亡是发生NMOSD病理改变的起始事件，保护星形胶质细胞免受AQP4抗体的伤害从而减少继发性瀑布效应可能阻止NMOSD的发生。

核转录因子NF-κB通过调节下游靶基因如许多炎性因子的基因表达在炎性和免疫反应的调控中发挥重要作用。研究表明该因子涉及许多中枢神经系统疾病如多发性硬化、脑卒中、癫痫、帕金森病等的发病机制[6]。在缺乏补体的环境下，AQP4抗体阳性血清能激活大鼠星形胶质细胞NF-κB信号通路，上调多种炎性基因表达，提示AQP4抗体诱导的星形胶质细胞NF-κB依赖性炎性反应可能涉及NMOSD的早期发病机制[4-7]。

PDTC主要通过直接清除活性氧中间产物以及螯合金属离子发挥其特异性阻断NF-κB传导通路，抑制NF-κB活化的作用[8]。其通过抑制NF-κB活化，减少下游炎性因子基因表达进而保护星形胶质细胞免受伤害[9]。本研究发现PDTC预处理能明显减少AQP4抗体阳性血清对星形胶质细胞的毒性作用，提示AQP4抗体阳性血清对星形胶质细胞的毒性作用中可能涉及NF-κB活化。

NF-κB p65入核和p-p65水平增加是NF-κB信号通路活化的关键标志[10]。本研究中使用双荧光免疫细胞化学法观察其入核情况，发现抗体组星形胶质细胞核内存在NF-κB p65表达，对照组以及PDTC预处理组并未发现NF-κB入核。同时作者使用Western blot方法测定NF-κB p-p65蛋白表达水平，也发现抗体组NF-κB p-p65蛋白表达水平增加，也支持AQP4抗体阳性血清能诱导星形胶质细胞NF-κB的活化。

补体失活的AQP4抗体阳性血清并不引起体外培养的星形胶质细胞死亡[11]。暴露AQP4抗体阳性血清的星形胶质细胞中许多炎性趋化因子、炎性因子等基因表达增加[7]。上述研究结果提示单独AQP4抗体和星形胶质细胞膜上AQP4结合仅能引起细胞功能的变化，尤其是诱发星形胶质细胞的炎性反应，可能使其对补体依赖性或抗体介导的细胞毒性作用更敏感，因此稳定星形胶质细胞功能可能减少AQP4抗体诱导的星形胶质细胞死亡，从而阻止NMOSD的发生发展。本文作者研究组既往曾观察到AQP4抗体引起星形胶质细胞谷氨酸转运体-1表达下调，而使用头孢曲松钠可上调谷氨酸转运体-1的表达，减少谷氨酸导致的氧化应激反应从而保护星形胶质细胞[12]，以及本研究中使用NF-κB抑制剂PDTC预处理能增加星形胶质细胞存活率，均支持以上学说。

星形胶质细胞NF-κB活化能诱导下游一系列炎性因子的释放，募集中性粒细胞聚集在病变部位，加重局部炎性反应，同时产生的炎性因子又反馈性促进星形胶质细胞的死亡。故选择阻断星形胶质细胞的NF-κB活化的药物可能为NMOSD提供新的治疗靶点。

总之，AQP4抗体阳性血清能激活星形胶质细胞NF-κB通路，抑制NF-κB活性可减轻星形胶质细胞的损伤。NF-κB的激活可能涉及NMOSD早期的发病机制，抑制其活性可能减轻NMOSD的发生发展。

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NF-κBisinvolvedinthecytotoxiceffectofanti-aquaporin-4antibodypositiveserumonastrocytes

LIXiaohui，LIYan，CAOXiaoyun，RENShiqing.

*DepartmentofNeurology，ThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，ShijiazhuangHebei050051，China

REN Shiqing，Email：renshiq6666@163. com

ObjectiveTo investigate whether NF-κB signal pathway is involved in the toxic effects of AQP4 antibody positive sera to astrocytesinvitro.MethodsThe purified cerebral cortical astrocytes from newborn Sprague-Dawley rats were used for the experiments.The cultured cells were divided randomly into four groups： a control group， a pyrrolidinedithiocarbamic acid (PDTC) group， AQP4 antibody group and an AQP4 antibody+PDTC group. The cells in the control group were given 10% volume ratio of healthy human sera;cells in the PDTC group were preincubated with PDTC(10 μmol/L ) for 1 h and then treated with healthy human sera;cells in the AQP4 antibody group were added the same volume of AQP4 antibody-positive sera;the AQP4 antibody+PDTC group were exposed to AQP4 antibody positive sera after PDTC preincubating. After 12 h of cultivation， astrocyte viability was tested by MTT assay，the nuclear translocation of NF-κB p65 was detected by immunofluorescense staining，and the protein expression of NF-κB p65 and phosphorylated p65(p-p65) were assayed by western blot.ResultsThe translocation of NF-κB p65 from the cytosol into the nucleus were found in the AQP4 antibody group，which was obviously reduced in the AQP4 antibody+PDTC group.The optical density value in the AQP4 antibody+PDTC group and the AQP4 antibody group were 0.4380±0.005 and 0.3897±0.045(F=133.355，P<0.05).No statistical difference of the expression levels of NF-κB p65 existed among the groups (P>0.05).The AQP4 antibody+PDTC group showed decreased the expression of p-p65 compared with the AQP4 antibody group (F=10.794，P<0.05).ConclusionsAQP4 antibody-positive sera could induce astrocyte injury by activating NF-κB signaling pathway and inhibiting the activity of NF-κB can protected astrocytes against the cytotoxic effect of AQP4 antibody positive sera.NF-κB signal pathway may be involved in the cytotoxic effect of anti-aquaporin-4 antibody positive sera on astrocytes.

neuromyelitis optica spectrum disorder;aquaporin-4; astrocytes; NF-κB

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.06.003

河北省财政厅资助项目(361005)

050051 河北医科大学第三医院神经内科

任士卿，Email：renshiq6666@163.com

R744.5+2

A

1006-2963(2017)06-0390-05

2016-10-10)

邹晨双)