MicroRNA-638在骨肉瘤中表达下调及对其细胞增殖的影响

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(南华大学附属第二医院骨科，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

MicroRNA-638在骨肉瘤中表达下调及对其细胞增殖的影响

陈斌，符勇，夏雪，郭伟明，金浩成，王晓旭*

(南华大学附属第二医院骨科，湖南 衡阳 421001)

目的探讨miR-638在人骨肉瘤(OS)细胞增殖行为中的影响。方法通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miRNA-638在人OS组织及癌旁组织、人OS细胞株(MG63、U2OS、HOS、SaOS2)和正常人成骨NHOst细胞株中的表达；用LipofectamineTM2000转染miR-638模拟物或抑制物，细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)检测转染后的吸光光度值，平板克隆形成实验检测菌落数量。结果miR-638在各组细胞中均有表达；OS细胞株中miR-638的表达明显下调(P<0.05)；高表达miR-638能抑制OS MG63和U2OS细胞的增殖(P<0.05)。结论miR-638高表达能抑制OS细胞的增殖。

骨肉瘤； MG63； U2OS； MicroRNA-638； 细胞增殖

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是儿童和青年中最常见的一种侵袭性骨肿瘤，最常见的原发部位为胫骨近端、肱骨近端及股骨远端，大约60%的病例是10～20岁的青少年患者,占青少年肿瘤的6%[1]。在近几十年来，人们虽然付出了大量努力来明确OS的致癌机制，但OS的生存率到达了一个瓶颈，晚期OS的预后依然很差。其增殖速度快、易转移的特点，使得OS在临床上的死亡率和致残率都很高。

MicroRNA，简写为miRNA，又名微小RNA，是内源性的、短小的单链RNA分子，由19．25个核苷酸组成，不参与蛋白质的编码，但调节基因的表达。因为miRNA与靶mRNA不完全互补配对，所以每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以共同调节同一靶基因，由此形成复杂的调控网络，精细调控功能基因的表达。miRNA是肿瘤分子生物学研究领域的热点,研究发现血清/血浆中存在上百种miRNA，在肿瘤的发生、发展和转移过程中有举足轻重的作用，尤其在肿瘤的诊断、治疗及预后监测方面具有应用价值。Wang等[2]检测了非小细胞肺癌SPC-A1细胞培养上清液中miR-638表达水平及细胞凋亡率以及裸鼠移植瘤模型后体内的血清miR-638表达水平。结果显示血清miR-638水平与非小细胞肺癌患者的生存率是相关的，在临床上miRNA-638水平可能被视为非小细胞肺癌预后的潜在独立预测因子。但miR-638在人OS细胞增殖行为中的作用一直不明确，鉴于文献报导miR-638对肿瘤的抑制作用，本实验以miR-638为研究对象，观察其在OS组织中的表达及对OS细胞系(MG63、U2OS)增殖的影响，为miRNA-638成为人OS新的有前景的治疗靶点提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1组织与细胞收集中山大学肿瘤研究所2008年1月～2012年12月OS组织及癌旁组织标本64对，平均年龄21岁，其中男性42例，女性22例，收集后液氮冷冻。所有标本取得都获得了家属知情同意，且此项目经附属医院临床研究伦理委员会批准。所有收集的标本符合OS诊断，即有典型临床症状、体征、相应影像学表现及病理学形态，术前未经局部及全身治疗。OS细胞株(MG63、U2OS、HOS、SaOS2)及永生化的正常骨组织细胞株NHOst购买于上海美轩公司。

1.2实验试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇、无酶水(用双蒸水按1∶1 000的比例稀释DEPC原液，振摇混匀，37 ℃过夜，高温高压使DEPC降解)、75%乙醇、RNAiso Reagent试剂盒(日本TaKaRa公司)、RT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(日本TaKaRa公司)、PBS缓冲溶液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、胎牛血清、miR-638 mimic、miR-638 inhibitor、mimic NC、inhibitors NC(上海吉玛公司)、LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)。

1.3仪器设备高速冷冻离心机、各种量程移液器、吸头、EP管、PCR管、NanoDrop 2000、超净工作台、PCR热循环仪、Thermal Cycler Dice Real Time System II 、6孔板和96孔板、细胞计数板、细胞培养箱、超速离心机、生物安全柜、倒置显微镜、酶标仪、-80 ℃超低温冰箱。

1.4实验分组定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测各组织中miR-638相对表达量分组：实验组为64组人骨肉瘤组织/人骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2细胞株；对照组为64组对应的非癌组织/永生化的正常骨细胞株NHOst。

细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)实验分组：实验组为分别转染miRNA-638 mimic与miRNA-638 inhibitor的MG63、U2OS细胞株；阴性对照组为分别转染mimic NC与inhibitor NC的MG63、U2OS细胞株。

平板克隆形成试验分组：实验组为转染 miRNA-638 mimic的MG63、U2OS细胞株；阴性对照组未转染的MG63、U2OS细胞株。

1.5人OS细胞的培养将标本于37 ℃ 水浴溶化呈悬液，于培养基内混匀,离心后弃上清,将细胞沉淀用1.0 mL培养基混匀加入装有14.0 mL培养基质的75 cm2方瓶中，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。待细胞生长融合至80%～90%时开始传代，继续放置于饱和湿度37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，2～3天更换培养基，之后根据细胞生长情况继续给予传代。

1.6 qRT-PCR检测各组织中miR-638的表达按RNAiso Reagent说明书分别提取实验组与对照组的总RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA质量和浓度。应用PrimeScript RT试剂盒进行反转录反应，反应在Applied Biosystems 2700热循环仪上进行。按说明书操作，配置反应液的所有操作均在冰上进行。反应体系如表1。逆转录反应条件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s,4 ℃(注：10 μL反应体系最多使用500 ng的Total RNA)。将反转录的cDNA样品按照适当的比例稀释后，应用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，在Thermal Cycler Dice Real Time System II 扩增仪上进行PCR反应，实验流程按说明书进行，反应体系如表2。每个样本设3个复孔，以U6为内参，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。根据PCR所得的CT值运用2-△△CT法计算miRNA-638的相对表达量。

表1 反转录合成cDNA反应体系

表2 反转录合成cDNA反应体系

1.7 CCK-8实验及平板克隆形成实验

1.7.1 细胞铺板 以MG63细胞为例。取处于对数生长期且细胞汇合度约为80%的MG63细胞，去除培养基后，经胰蛋白酶溶液消化呈悬浮状态时，终止消化并轻柔吹打使细胞全部脱壁。将细胞悬液置入10 mL PE管中，在37 ℃恒温下，离心后去上清液，继续加入培养液，轻柔吹吸使细胞悬浮。分别吸取10 μL细胞悬液加入相应细胞计数板，计算悬液浓度以及吸取3 000个细胞所需悬液体积。继续轻柔吹吸离心管中悬液50次后，加入相应体积细胞悬液至96孔板的6组中，然后每孔添加培养液至150 μL，周围孔取100 μL PBS溶液填充，铺完后 “十字”摇匀。每次铺4块96孔板，分别用作24 h、48 h、72 h和96 h的CCK-8实验，每隔48 h换液。U2OS细胞铺板步骤同MG63细胞。

1.7.2 细胞转染 转染步骤参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行。

1.7.3 CCK-8实验 转染完成后，在细胞箱中继续培养。每24 h取一块孔板，在每一孔中加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h。在酶标仪中震动10 min，用490 nm波长测定OD值，以630 nm为参考波长。

1.7.4 平板克隆形成实验 取培养于10%胎牛血清RPMI培养基中的对指数生长期的MG63、U2OS细胞以及转染miR-638 mimic的MG63、U2OS细胞，分别制成每毫升200个细胞的细胞悬液。取MG63/MG63-mimic细胞系液2 mL,U2OS/U2OS-mimic细胞悬液取4 mL,分别接种于六孔板的每一个孔中，使细胞分散均匀。六孔板置于37 ℃ 、5% CO2的培养箱中培养2周。当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养。甲醇固定15 min后空气干燥。用0.1%结晶紫进行染色20 min，倒置显微镜观察超过30个细胞的菌落数。

1.8数据处理及统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。基因相对表达量用2-△△CT法计算。

2 结 果

2.1 qRT-PCR实验检测骨肉瘤组织、癌旁组织、骨肉瘤细胞及正常人骨细胞中成熟的miR-638的表达水平qRT-PCR检测了64组骨肉瘤组织中成熟的miR-638的表达水平。结果显示与相应的非癌组织(对照组)相比有36组(56.25%)骨肉瘤组织中miR-638的表达是下调的(P<0.001,图1)。

图1 64组骨肉瘤及癌旁组织中成熟的miR-638的表达水平 与对照组比较，*：P<0.001

实时荧光定量聚合酶链反应技术分别检测骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2细胞株和永生化的正常骨组织细胞株NHOst(对照组)中的miR-638的表达水平。结果显示在骨肉瘤细胞株中miR-638的表达明显下调(P<0.001，图2)。

图2 荧光定量PCR检测骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2细胞株与人正常骨组织细胞株NHOst中miR-638的表达与对照组NHOst比较，*:P<0.001

2.2 CCK-8实验检测miR-638的高表达或低表达对骨肉瘤MG63及U2OS细胞的增殖能力的影响

结果显示miR-638高表达能显著降低MG63和U2OS细胞的增殖能力(P<0.05,见图3)。抑制miR-638表达显著促进了MG63和U2OS细胞的生长(P<0.05,图4)。

2.3平板克隆实验检测高表达miR-638对骨肉瘤MG63及U2OS细胞的集落形成能力的影响结果显示miR-638的高表达能抑制人骨肉瘤MG63及U2OS细胞的增殖功能(P<0.05,图5、图6)。

图3 高表达miRNA-638抑制人OS MG63与U20S细胞增殖与对照组比较，*:P<0.05

图4 抑制miR-638的表达促进人OS MG63与U20S细胞增殖与对照组比较，*:P<0.05

图5 高表达骨肉瘤U2OS细胞中的miR-638会抑制其集落形成能力与对照组比较，*:P<0.05

图6 高表达骨肉瘤MG63细胞中的miR-638会抑制其集落形成能力与对照组比较，*:P<0.05

3 讨 论

研究表明，OS的病因极其复杂，同时还具有庞大基因组的不稳定性及高度异常的核型，多个染色体拷贝数的增加或者丢失会使得OS中多条染色体发生改变[3]。OS的治疗包括手术、术前和术后的标准化疗或放疗，5年生存率为60%～70%；晚期诊断、转移性及复发性的肿瘤患者生存率更低(20%)，而其中位生存期仅为23个月[4]。为了监测OS的发展、改善OS患者的预后，探索一种能用于OS早期诊断的更方便、微创的方式，寻找新的治疗靶点成为OS诊断及治疗上亟需解决的问题。

深入研究发现，许多miRNA都在细胞增殖、凋亡、分化、运动等过程中起着重要调控作用。自20年前发现他们以来，生物信息学研究已经确定了超过1 000种的miRNA可参与人类基因组中一半基因的调节，每个miRNA可能控制数百个人类基因的转录[5]。超过50%的miRNA基因位于染色体脆弱位点，它的缺失或扩增对人类癌症有重要影响，提示miRNA直接参与肿瘤的发生过程[6]。2002年Calin等人发现 miRNA-15a和miRNA-16-1可能与慢性淋巴细胞白血病的发病密切相关[7]。这一重要发现公布以后，人们逐渐在大量的肿瘤细胞系和临床肿瘤样本中发现了异常表达的miRNA，随后在动物模型实验也证实了miRNA对肿瘤的发生、发展有着重要作用[8]。

Tan等[9]人的研究发现在乳腺癌进展中，miR-638 是最重要的因子之一，miR-638 强制性表达可显著降低细胞增殖率及三阴乳腺癌细胞侵袭能力。在Ma的研究中[10]发现，大肠癌标本中的miR-638由于肿瘤分级不同而表达不同。miR-638 抑制 Sox2的表达，同时，miR-638表达水平与在人结直肠癌组织中 Sox2 m RNA 表达水平呈负相关，这些可以说明miR-638可以作为一种新的结直肠癌侵袭相关肿瘤抑制因子。

鉴于miR-638在前期研究中“抑癌基因”的作用，本实验采用实时荧光定量PCR的方法检测64组人OS组织及相应的非癌组织中成熟的miR-638的表达水平，结果显示与相应的非癌组织相比有36组(56.25%)OS组织中miR-638的表达是下调的，推测miR-638的表达下调可能对人OS的发生发展有促进作用，而并不能说明miRNA-638的表达与OS患者的生存率有显著相关性，同时miR-638的表达与性别、年龄，肿瘤的位置、大小、分期与分级也没有显著的联系。在CCK-8实验中，与相应的对照组相比，转染miR-638 mimic的实验组细胞增殖速度明显减慢，而转染miR-638 inhibitor的实验组细胞增殖速度明显加快。这与之前研究miRNA-638的“抑癌基因”作用一致。

值得提出的是，在转染mimic与inhibitor的实验组中，随着实验时间的推移,其增殖速度有一定的加快或减慢。主要考虑miR-638 mimic及inhibitor为瞬转,其mimic及inhibitor随着时间推移在细胞中逐渐降解，导致细胞增殖速度有一定变化。另外，CCK-8实验作为检测细胞存活与增殖的方法之一，其检测原理同常规的MTT略有差异，试剂生成物具有高度水溶性，所以简便了实验步骤也提高了实验的敏感性。有文献比较过两者的灵敏度和准确性，CCK-8法操作更简便,灵敏度高,准确性和重复性更好,是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法[11]。

本研究表明，在人OS组织中，miR-638呈低表达；miR-638的高表达显著抑制人OS MG63及U2OS的细胞增殖，而下调miR-638的表达能显著促进其增殖，为miRNA-638成为人OS新的有前景的治疗靶点提供了一定的理论依据。但还需继续进行体内荷瘤动物实验，及进一步研究miR-638抑制人OS细胞增殖的作用机制，为基础研究成果转化为临床生物治疗打下基础。

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EffectofMicroRNA-638expressionontheproliferationofhumanosteosarcomacells

CHEN Bin,FU Yong,XIA Xue,et al

(DepartmentofOrthopaedics，theSecondAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001，China)

ObjectiveTo investigate the role of miR-638 in biological behavior of osteosarcoma cell.MethodsThe expression of miR-638 in osteosarcoma MG63 and U2OS cells was detected by RT-PCR.miRNA-638 mimics (inhibhors) were transfected into MG63 and U2OS by using LipofectamineTM2000 to upregulate(deregulate) the expression of miRNA-638.The absorbance value in 24 h,48 h,96 h and 72 h following the transfection was detected by CCK-8.And colony forming assay was used to detect colony counts over 30 cells after 2 weeks.ResultsMiR-638 expressed in each group.The expression of miR-638 was down regulated (P<0.001) in the 36 groups (56.25%) compared with the corresponding non cancerous tissues.Mir-638 expression can significantly reduce the MG63 and U2OS cells growth rate (P<0.05),on the contrary,the suppression of miR-638 expression significantly promoted the growth of cells of U2OS and MG63 (P<0.05).ConclusionsHigh expression of miR-638 significantly inhibits the proliferation of osteosarcoma cells.MiR-638 may become a new target for the early diagnosis and treatment of osteosarcoma.

osteosarcoma; MG63; U2OS; MicroRNA-638; cell proliferation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.004

2017-02-10；

2017-06-18

湖南省教育厅资助项目(15C1215).

*通讯作者，E-mail:wxx1024@163.com.

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