Atg5和Atg7在儿童急性白血病中的表达及相关分析

吴晓莉，高 兴，刘 娜，赵晓庆，马夫天，张宝玺

(河北医科大学第二医院儿科，河北 石家庄 050000)

·论著·

Atg5和Atg7在儿童急性白血病中的表达及相关分析

吴晓莉，高 兴，刘 娜，赵晓庆，马夫天，张宝玺*

(河北医科大学第二医院儿科，河北 石家庄 050000)

目的探讨Atg5蛋白、Atg7蛋白表达水平与儿童急性白血病(acute leukemia，AL)发生发展的关系。方法选取初诊未治AL患儿50例，根据疾病类型分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)组30例，急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)组20例；另选取非恶性血液病患儿20例为对照组。采用免疫组织化学染色法对骨髓细胞中Atg5蛋白、Atg7蛋白进行检测。结果ALL、AML组Atg5蛋白表达阳性率高于对照组，AML组Atg7蛋白表达阳性率高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman秩相关性分析结果显示Atg5与Atg7蛋白表达水平无相关性(rs=0.333，P>0.05)。结论Atg5蛋白在AL中表达上调，可能参与了AL的发生发展；Atg7蛋白在AML中表达升高，可能与AML的发生发展有关。

白血病,淋巴样；白血病，髓样；儿童

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.014

急性白血病(acute leukemia，AL)是一类常见的异质性较强的造血干细胞恶性增殖性疾病，在儿童恶性疾病中，白血病的发病率最高，其中AL占90%～95%，但其病因及发病机制至今尚未完全明了。细胞自噬参与肿瘤的发生发展过程，其对肿瘤的生物学作用是一把双刃剑，其活性降低或增强可导致正常细胞发生恶性转化或促进肿瘤进展。目前认为自噬与儿童AL关系密切，但相关研究较少。自噬相关基因Atg5、Atg7蛋白在自噬体的形成过程中起关键作用，Atg5蛋白在自噬过程中起调控作用，Atg7蛋白参与自噬体的形成，其编码的蛋白直接参与自噬体的形成，基因的转录翻译影响因素多，尚未见用免疫组织化学染色的方法直接测定骨髓中Atg5、Atg7蛋白表达水平的研究，并且目前对于Atg7蛋白的研究多局限于基础实验。本研究应用免疫组织化学染色的方法，检测在自噬体形成过程中Atg5、Atg7蛋白表达水平，探讨自噬在白血病中的分子机制以及自噬与儿童AL发生发展的关系，旨在为AL的治疗提供新思路及策略。现报告如下。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选取2014年1月—2016年6月河北医学大学第二医院儿科住院的初诊未治AL患儿50例，根据疾病类型分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)组30例，男性17例，女性13例，年龄1～13岁，平均(5.4±2.2)岁；急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)组20例，男性13，女性7例，年龄1～12岁，平均(5.5±2.3)岁。另选取同期非恶性血液病患儿20例为对照组，男性11例，女性9例，年龄6个月～13岁，平均(6.6±2.2)岁，其中免疫性血小板减少症14例、营养性贫血6例。3组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究经过河北医学大学第二医院伦理委员会批准。均获得患儿父母的知情同意并签署知情同意书。

1.2标本采集 采集新鲜骨髓标本2 mL，自然凝固后经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片。

1.3主要试剂 兔抗人Atg5、Atg7 多克隆抗体(工作浓度分别为1∶100、1∶200)购自北京百诺威生物科技有限公司；DAB显色试剂盒、SP9001试剂盒购自北京中杉生物工程公司。

1.4方法 免疫组织化学染色法按照试剂盒说明书操作，石蜡切片常规脱蜡、脱苯、水化，抗原修复，结合一抗，滴加二抗，DAB染色，苏木精复染、脱水、透明、封片、观察，实验中用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.5结果判定 Atg5、Atg7阳性表达为胞浆、胞膜内出现从浅黄到深黄颜色不等的颗粒。双盲法阅片，参照Fromowitz阳性细胞半定量分级法，每例标本随机观察5个高倍视野(×400)，按阳性细胞染色强度及所占百分比进行积分：首先按染色强度评分，不染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；然后根据白血病细胞阳性细胞所占的白血病细胞百分数进行积分，染色数目≤25%为1分，染色数目26%～50%为2分，染色数目51%～75%为3分，染色数目>75%为4分；再根据2项相加所得总分进行分析，0～2分为阴性，3分及以上为阳性。

1.6统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13组Atg5、Atg7蛋白表达比较 ALL、AML组Atg5蛋白表达阳性率高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；ALL与AML 组Atg5蛋白表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。AML组Atg7蛋白表达阳性率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；ALL与AML组、ALL与对照组Atg7蛋白表达阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组Atg5和Atg7蛋白表达比较Table 1 Expression level of Atg5 and Atg7 protein in three groups (例数，%)

*P<0.05与ALL组比较 #P<0.05与AML组比较(χ2检验)

2.2相关性分析 Spearman秩相关性分析结果显示， Atg5与Atg7蛋白表达水平无相关性(rs=0.333，P>0.05)。

3 讨 论

AL是造血系统的恶性增殖性疾病，是儿童最常见的恶性肿瘤。细胞自噬(autophagy)是所有真核生物共有的分解代谢途径，是一种在进化上高度保守的分解代谢方式，通过溶酶体降解体内多余的蛋白质及亚细胞成分等并进行重新利用从而为细胞提供物质及能量基础，以维护细胞代谢平衡和细胞内环境稳定[1]。自噬通过“自食”成为一种内在的细胞保护机制。因此，被称为细胞的“清道夫”。细胞自噬参与了多种生理病理过程，在动物疾病的发生发展中起着重要的作用[2]。研究表明，细胞自噬与多种人类疾病密切相关，如神经退行性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病及肿瘤等疾病[3-4]。研究发现自噬在肿瘤的诱发和恶变中充当矛盾的角色。正常生理情况下，细胞通过自噬清理细胞代谢废物，消除了致癌因素的产生，从而保持细胞的正常功能和基因组稳定性，故最初被认为是一种抑制恶性转化的过程。而当自噬功能异常时，则会使致癌的有害产物不断累积。近年来的研究表明，细胞自噬在各种白血病的发病和治疗中均起着重要作用[5-6]，并且与白血病细胞的耐药密切相关[7-8]。mTOR信号途径的调控与自噬的活性密切相关[9]，在恶性肿瘤细胞中，由于缺氧、营养供应不足、酸中毒等情况，mTOR信号通路被抑制，细胞自噬活性增强，自噬为肿瘤的代谢提供基本的物质及能量基础，为肿瘤细胞的再生和转移提供了机会[10]。当肿瘤细胞面临化疗、放疗后，会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，自噬活性升高有利于及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量，为修复受损细胞赢得时间。因此，自噬又可以促进肿瘤细胞的生长及转移。细胞自噬在肿瘤中的研究尤其突出。糖皮质激素可以诱导细胞凋亡，故广泛用于ALL治疗中，研究显示低剂量Bcl-2拮抗剂甲磺酸盐可以解离Beclin1基因并且降低mTOR的活性，激活细胞自噬性死亡而逆转耐药，从而增强地塞米松的治疗效果。此外，mTOR抑制剂依维莫司(RAD001)可以引起ALL幼稚细胞凋亡及自噬性死亡；依维莫司不仅可以提高Beclinl基因的表达而诱导自噬，同时可以通过磷酸化磷酸腺苷激活的蛋白激酶调节mTOR的活性，减少白血病细胞浸润，提高患者生存率。三氧化二砷(As2O3) 可以促进肿瘤细胞发生自噬并利用自噬溶酶体降解PML/RARa蛋白，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的[11]。由此可见，自噬可作为白血病治疗的新思路，但自噬在不同类型的肿瘤及同一类型肿瘤的不同发展时期，甚至同一肿瘤的不同部位，扮演着不同的角色。自噬与白血病关系的研究逐渐深入，希望借助此研究，使白血病的诊断、分型、化疗方案的制定、预后评估等更加完善，以提高患儿的治愈率及生存质量。

自噬在肾透明细胞癌中表达水平下调，而这种下调与多种自噬相关蛋白的表达变化相关[12]。Atg5是参与细胞自噬的重要基因之一，位于人类染色体6p21，含384个核苷酸多态性位点，共编码276个氨基酸。Atg5参与自噬体形成，促进自噬前体膜的延伸。发生突变的Atg5不能与Atg12相结合，影响自噬体的形成，使自噬表达下调。Atg7是一种泛素E1样连接酶，可以激活泛素样蛋白Atg12和哺乳动物中的所有3种Atg8。Atg7在自噬体的形成过程中起到了重要的调控作用。并且自噬相关因子Atg7结合并调控p53介导的细胞周期阻滞细胞老化，提示Atg7可能发挥抑制肿瘤形成的作用，但其具体机制尚不明确。为了进一步探索自噬在维持造血干细胞稳定性中的作用，有研究证实小鼠中Atg7的表达缺失破坏了正常造血干细胞的作用，推测Atg7在维持造血干细胞稳定性中起到十分关键的作用[13]。Atg5 mRNA在ALL骨髓细胞中表达水平升高，但在AML中表达水平降低，随着危险度的增高，2种类型的白血病自噬活性均呈明显下降趋势[14]。并且有研究表明在婴幼儿血管瘤增殖期[15]、前列腺癌、卵巢癌中，Atg5表达水平上调，但是在胃癌[16]、结肠癌等疾病中表达水平下调，可见同一指标在不同疾病，在同一疾病的不同阶段及病理分型中表达水平亦有不同，更近一步证实自噬是复杂连续的过程。有研究通过RT-PCR方法证实在儿童AL骨髓单个核细胞中Agt3、Atg5表达水平增强，提示其自噬活性增强[17]。本研究采用免疫组织化学染色方法直接检测Atg5编码蛋白的表达情况，发现ALL和AML级Atg5蛋白表达阳性率高于对照组，但是在ALL与AML间表达差异无统计学意义，提示Atg5在AL的发生发展过程中起到重要的调控作用，本研究结果与RT-PCR方法实验结论不谋而合。目前对Atg7的研究多局限基础实验，有实验证实Atg7在维持造血干细胞稳定方面起到关键作用，发现Atg7在儿童AL与对照组相比表达水平差异无统计学意义，分别将ALL与AML、对照组进行比较，其表达水平差异无统计学意义，但是AML中Atg7表达水平呈上升趋势，提示Atg7在AML的发病过程中起到调节的作用。Atg5、Atg7在各组间均有表达，但其表达水平受疾病种类、分型的影响。

总之，Atg5、Atg7在不同肿瘤中表达水平不同，自噬活性的变化可从肿瘤细胞凋亡、血管生成及抗肿瘤治疗等多个层面影响肿瘤进程，今后仍需进一步研究，探索自噬相关基因在白血病发病中的临界值，从而有利于治疗方案的选择。

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ExpressionandcorrelationanalysisofAtg5andAtg7inchildhoodacuteleukemia

WU Xiao-li, GAO Xing, LIU Na, ZHAO Xiao-qing, MA Fu-tian, ZHANG Bao-xi*

(DepartmentofPediatrics,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveTo explore the relationship of the expression level of Atg5 protein and Atg7 protein with the occurrence and development of leukemia.MethodsFifty children who were newly diagonesd with acute leukemia(AL) were collected as experiment group, including 30 cases of acute lymphoblastic leukemia(ALL) and 20 cases of acute myelogenous leukemia(AML). Twenty cases of non-malignant hematological disease children were selected as control group. Immunohistochemical staining was used to test the expression level of Atg5 protein and Atg7 protein in bone marrow cells.ResultsThe positive rate of Atg5 protein expression in ALL and AML group was higher than that in control group, and the positive rate of Atg7 protein expression in AML group was higher than that in control group, the difference was statistically significant(P<0.05). Spearman rank correlation analysis showed that there was no correlation between the expression of Atg5 and Atg7 protein(r=0.333,P>0.01).ConclusionAtg5 protein is up-regulated in AL and may be involved in the development of AL. The elevated expression of Atg7 protein in AML may be related to the occurrence and development of AML.

leukemia, lymphoid； leukemia, myeloid； child

2017-07-27；

2017-08-15

河北省科技计划项目(152777206)

吴晓莉(1973-)，女，河北辛集人，河北医科大学第二医院副主任医师，副教授，医学博士，从事小儿血液肿瘤疾病诊治研究。

*通讯作者

R733.7

A

1007-3205(2017)1418-12-04

赵丽洁)