松树皮提取物对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

姚期，余资江，孙宝飞

(1.贵州医科大学基础医学院 人体解剖与组织胚胎学教研室，贵阳 550025； 2.贵阳中医学院第二附属医院 耳鼻咽喉科，贵阳 550003)

研究报告

松树皮提取物对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

姚期1,2，余资江1*，孙宝飞1

(1.贵州医科大学基础医学院 人体解剖与组织胚胎学教研室，贵阳 550025； 2.贵阳中医学院第二附属医院 耳鼻咽喉科，贵阳 550003)

目的探讨IL-6/STAT3/miR-21在松树皮提取物对脑缺血再灌注损伤小鼠的神经治疗作用和机制。方法将120只KM小鼠随机分为正常对照组、假手术组、14 d及28 d模型组、14 d及28 d治疗组，每组20只，采取双侧颈总动脉夹闭法制作脑缺血再灌注损伤模型；治疗组在处死前7 d给予松树皮提取物原花青素灌胃治疗，对照组和假手术组采用等量生理盐水灌胃。检测各组小鼠学习、记忆能力的差异及海马组织病理学改变、白介素6、STAT3、p-STAT3蛋白、miR-21的表达水平。结果同时间节点治疗组小鼠比模型组小鼠学习记忆能力强；治疗组尼氏体排列紊乱，其中一部分细胞形态不规则，胞质着色相对较浅，但比模型组好；28 d模型组IL-6表达水平低于14 d模型组，同时间点治疗组海马组织中的IL-6较模型组明显减少；海马组织中STAT3总蛋白含量各组间差异无显著性(P>0.05)，同时间点治疗组p-STAT3含量低于模型组；海马组织中miR-21在14、28 d治疗组的表达低于同时间点模型组，且随时间的延长而降低。结论松树皮提取物原花青素能通过有效抑制IL-6，显著降低STAT3磷酸化水平，最终降低miR-21表达，从而发挥减轻小鼠脑缺血再灌注脑损伤的作用。

松树皮提取物；原花青素；缺血再灌注损伤；学习记忆；小鼠

脑血管病作为导致人类死亡或生活质量下降的三大高发疾病之一，在众多的脑血管病中又以缺血性脑血管病最为常见[1]。目前其主要治疗方案主要是争取在最短的时间内恢复缺血区的血液供应，其目的是尽可能的减轻缺血区域相应的神经细胞损伤。但在临床实践中发现，恢复缺血区域血液供应后缺血区域神经功能和结构损伤反而较缺血时严重，这一病理现象即脑缺血再灌注损伤(CIRI)。目前发现炎性细胞因子、STAT3、miR在CIRI这一病理生理过程中有着重要的调控作用[2-4]。松树皮提取物中含大量原花青素(oligomeric procyanidins,OPCs)，目前研究表明原花青素对CIRI有治疗作用[5]，但其作用机制尚不十分明确。本研究通过观察松树皮提取物原花青素治疗CIRI模型小鼠，在学习记忆能力、细胞学上的差别，不同时间点检测大脑海马区组织中miR-21、STAT3、p-STAT3、IL-6表达的差别，探讨松树皮提取物中原花青素治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄清洁级成年KM小鼠120只，由贵州医科大学实验动物中心提供【SCXK(黔)2012-0004】，体重20～22 g。置于室温为(20±2)℃，湿度49%～62%环境中饲养，并正常饮食。

1.2 分组及动物模型的制作[6]

将120只小鼠按随机分组原则分为6组，即正常对照组、假手术组、14 d模型组及治疗组、28 d模型组及治疗组，每组20只。假手术组、14 d模型组及治疗组、28 d模型组及治疗组小鼠术前12 h予以禁食，术前6 h予以禁饮，以避免手术过程中误吸导致死亡影响实验结果。采用小动脉夹夹闭双颈总动脉法制作小鼠脑缺血再灌注损伤模型。当小鼠出现抽搐、呼吸深慢、心跳加速提示脑缺血再灌注损伤模型制作成功。假手术组小鼠操作同上，除外双颈动脉夹闭过程。

1.3 Morris水迷宫实验[7]

本实验分为两部分，即定位航行实验和空间探索实验，测试各组小鼠的空间学习记忆能力。在整个实验过程水温恒定在25℃左右。

1.4 标本的收集

小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉成功后，碘伏消毒3次后，迅速断头并置于预先准备好的冰块上取脑，将取出的脑组织海马CA3区分为四部分。

1.5 HE染色

常规脱水、浸泡、包埋，使用切片机将组织蜡块做成6 μm的切片，并将切片小心贴在多聚赖氨酸玻片上，HE染色后显微镜观察并照相。

1.6 miR-21的检测[8]

取一部分标本，以离心柱法提取总RNA，电泳得到RNA条带，电泳完成后用凝胶成像系统检测条带，逆转录过程按照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer说明书方法进行(42℃，60 min；70℃，10 min)，PCR反应条件①预变性(95℃，30 s)；②变性(95℃，10 s)；③退火(58℃，20 s)；④延伸(70℃，1 s)；第②～④步骤循环40次，读板。保存图像及数据。实时定量PCR结果由荧光定量分析仪自动采集给出目的基因和参比基因的CT值，基因表达量采用实验组/对照组=2-△△CT进行计算，其中△△CT=(CT目的- CT内参)实验-(CT目的-CT内参)对照，通过2-△△CT计算miR-21与内参相对表达量，实验重复多次取其平均值进行数据分析。

1.7 IL-6的检测

ELISA法检测IL-6的表达。

1.8 STAT3、p-STAT3

Western Blot测定STAT3、p-STAT3蛋白的表达，β-actin作为内参。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 一般行为观察

对各组小鼠观察发现：正常对照组和假手术组小鼠行为活跃、给予刺激后的反应灵敏迅速；模型组的小鼠行为活动明显减少，给予刺激后明显较正常对照组和假手术组反应迟钝，甚至无反应；给予松树皮提取物治疗后28 d组小鼠行为活动较正常对照组和假手术组差，但较模型组活泼，对外界刺激反应较为迅速活跃，趋近于正常水平。

2.2 Morris水迷宫检测

Morris水迷宫检测数据见(表1)，结果显示：(1)从小鼠在定位航行实验中表现来看：假手术组与正常对照组相比数据差异无显著性(P>0.05)，对照组、假手术组小鼠的逃避潜伏期耗费明显比14、28 d模型组少，差异有显著性(P<0.05)。28 d模型组小鼠逃避潜伏期成绩少于14 d模型组小鼠耗时(35.54±4.29、42.46±6.21)s，差异有显著性(P<0.05)；14、28 d给予OPCS治疗后小鼠逃避潜伏期耗费时间比同期模型组明显减少，但数据显示低于同期模型组(P<0.05)。(2)空间探索实验统计结果显示：假手术组与正常对照组小鼠耗费时间结果差异无显著性(35.98±5.11、37.01±6.42)s(P>0.05)，与假手术组相比14 d和28 d缺血再灌注模型组小鼠穿越原平台所在象限时间明显降低(18.31±2.91、26.91±4.23)s，差异有显著性(P< 0.05)，说明经历脑缺血再灌注损伤后小鼠的学习记忆功能明显降低，这其中以14 d模型组小鼠成绩降低最为明显；实验小鼠给予松树皮提取物原花青素治疗后比同期模型组小鼠记忆能力有所好转，差异有显著性(P<0.05)。

2.3 HE染色

小鼠脑缺血再灌注损伤后海马CA3区HE染色显示假手术组神经细胞排列整齐，并可见散在的、浅染的突起，表明其两组神经细胞无凋亡。而14 d模型组不但在数量上明显减少、排列紊乱，而且出现胞质浅着色，甚至出现胞核移位现象；14 d治疗组镜下也可见排列紊乱、胞质浅着色及胞核移位现象，但在数量上要比14 d模型组少(图1)。

2.4 小鼠海马组织中IL-6的测定

各组海马组织中IL-6结果显示如(表2)，假手术组与正常对照组检测结果差异无显著性(P>0.05)，模型组小鼠海马组织中IL-6表达同假手术组、正常对照组小鼠相比，14、28 d模型组海马组织中IL-6明显升高，差异有显著性(P<0.05)，表明缺血再灌注损伤后炎性因子表达增强，其中14 d模型组IL-6升高更为明显，结果显示模型组与假手术组比较差异有显著性(P<0.05)；经给予7 d松树皮提取物原花青素治疗后发现治疗组小鼠海马组织中IL-6 水平均低于同期模型组，差异有显著性(P<0.05)。

表1 各组小鼠Morris水迷宫检测实验结果比较Tab.1 Learning-memory abilities determined by Morris water maze test

注：▲P<0.05，vs正常组；■P<0.05，vs 14 d模型组；★P<0.05，vs 28 d模型组。
Note.▲P<0.05,vs the normal control group;■P<0.05,vs the 14 d model group;★P<0.05,vs the 28 d model group.

表2 各组小鼠海马组织匀浆中IL-6的比较Tab.2 Comparison of the total IL-6 in hypocampal tissue homogenates of different mouse groups

注：▲P<0.05 vs正常组；■P<0.05 vs 14 d模型组；★P<0.05 vs 28 d模型组。
Note.▲P<0.05 vs the normal control group;■P<0.05 vs the 14 d model group;★P<0.05 vs the 28 d model group.

注：A.假手术组; B.14 d模型组; C.14 d治疗组。图1 三组海马区CA3区HE染色结果比较(×200)Note.A.Sham group; B.14 d model group; C.14 d treatment group.HE staining.Fig.1 Comparison of the pathological changes of CA3 region in the hippocampus of the three mouse groups

2.5 STAT3蛋白的表达

STAT3、p-STAT3目的蛋白表达的灰度值与β-actin灰度值比对结果可见(图2、图3)。各组间总STAT3蛋白含量差异无显著性(P>0.05)。假手术组海马组织中的p-STAT3蛋白含量与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)；与假手术组比较，14、28 d模型组小鼠海马组织p-STAT3的蛋白含量明显高于假手术组，差异具有显著性(P<0.05)，14 d模型组小鼠海马组织p-STAT3蛋白含量高于28 d模型组；14、28 d治疗组海马组织p-STAT3蛋白含量与同时期模型组比较均降低，各实验组间差异均具有显著性(P<0.05)。

注：A.正常组；B.假手术组；C.14 d模型组；D.14 d治疗组；E.28 d模型组；F.28 d治疗组。(下图同)图2 各组蛋白印迹检测总STAT3表达比较Note.A.Normal control group; B.Sham group; C.14 d model group; D.14 d treatment group; E.28 d model group; F.28 d treatment group.(The same in the following Figures)Fig.2 Comparison of total STAT3 expression determined by Western blot

图3 各组蛋白印迹检测p-STAT3表达比较Fig.3 Comparison of p-STAT3 expression detected by Western blot

2.6 各组小鼠海马组织中miR-21的相对定量表达水平

假手术组海马组织miR-21含量与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05)；与假手术组比较，14、28 d模型组小鼠海马组织miR-21的含量显著高于假手术组，差异均有显著性(P<0.05)，14 d模型组小鼠海马组织miR-21含量高于28 d模型组；14、28 d治疗组海马组织miR-21含量与同时期模型组比较均降低，各实验组间差异均具有显著性(P<0.05)(图4)。

图4 各组小鼠海马CA3区组织匀浆中miR-21的比较Fig.4 Comparison of the total miR-21 in the hypocampal CA3 region tissue homogrnates of different mouse groups

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是一复杂的病理生理性变化，其涉及到的细胞因子及相互机制较为复杂，探寻一种能有效减轻或预防脑缺血再灌注损伤的药物或方法，是改善缺血性脑血管病患者预后的关键问题之一。

脑缺血早期TNF-α分泌量会在一定时间内呈上升趋势[9]，TNF-α又能参与和诱导IL-6的合成。细胞中IL-6不但能够通过激活STAT3信号通路而发挥对miRNA-21表达的调节作用[10]，IL-6还对神经元、内皮细胞、胶质细胞有着不可忽视的损伤[11]。Yamashita等[12]实验研究发现：使用IL-6受体单克隆抗体阻断剂后发现：小鼠大脑缺血区组织中的p-STAT3含量明显减少，缺血区域神经细胞凋亡大为减少、梗塞面积明显缩小、相应区域的功能损伤明显减轻，这说明阻断STAT3的活化在CIRI过程中可能具有神经保护作用，考虑抑制p-STAT3的表达与减少神经细胞的凋亡有关。

JAK-STAT通路是1992年由Sehindle在研究干扰素时发现，JAK-STAT通路是由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族组成，是以激活STAT3信号转导与转录的细胞内信号传导通路，它参与了中枢神经系统的发育、增殖、分化等过程，并在一些疾病(如肿瘤、缺血性脑病、脑缺血再灌注损伤等)的发生、发展过程中发挥重要的调节作用。罗云波[13]在实验中发现：脑缺血再灌注损伤后IL-6与IL-6R结合，使JAK/STAT信号传导通路激活，从而促使STAT3磷酸化，最后p-STAT3的表达增高。目前有研究表明JAK/STAT通路的激活还会使星形胶质细胞活化的，严重影响了神经功能的恢复[14]。

MicroRNA(miRNA)是一种广泛存在于从各种生物中的、长度为22个核苷酸长度的、高度保守的非编码内源性小分子RNA，其不具有开放阅读框、不编码蛋白质，但却有高度的稳定性，广泛的参与细胞的生长、凋亡等过程，具有一定的原癌基因活性，与炎症这一病理过程密切相关。一直以来miR-21表达增加被认为是抑制细胞凋亡和促进肿瘤的发生发展，但根据最近虞莉娜等[15]通过检测64名急性脑梗死患者血清中miR-21-5p、IL-6发现：IL-6与miR-21-5p的表达呈正比关系，miR-21-5p的高表达组的患者人群预后远远差于低表达组，显然在缺血性脑病这一疾病中miR-21的抑制细胞凋亡功能并未发挥主要作用。我们通过回顾miR-21与一些疾病(如：炎性肠炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性脑脊髓膜炎)的关系，我们不难发现在miR-21在这些疾病的病变部位和外周血中表达明显升高。其作用机制可能为：过表达的miR-21可以促进炎性因子(如：IL-6、TNF-α等)的分泌，进一步加重炎症反应[16]。

松树皮提取物原花青素属于生物类黄酮，具有廉价、天然、易获得、无明显致癌性和副作用的特点，目前普遍认为OPCs具有较强的抗氧化性和清除自由基功能，对炎症因子的表达也有抑制功能。已有研究表明松树皮提取物原花青素可能通过多种途径减轻脑缺血再灌注损伤。细胞凋亡是CIRI的关键，通过调节内源性基因的表达来抑制细胞凋亡是改善缺血性脑血管病预后的途径之一。根据以上研究结果，我们推测松树皮提取物原花青素治疗小鼠脑缺血再灌注损伤作用机制最终与miR-21的表达有关，目前尚未见OPSc治疗脑缺血再灌注损伤中IL-6、STAT3、miR-21之间相互作用途径的报道，本实验发现脑缺血再灌注损伤能够引起炎症因子IL-6表达增高，从而刺激小鼠脑内海马结构炎症反应，且脑缺血再灌注损伤所引起的细胞炎性因子IL-6水平升高又可促进STAT3激活，进而上调miR-21表达水平，其可能是导致学习、记忆能力损伤的原因之一。松树皮提取物能抑制IL-6水平，进而抑制STAT3激活，致miR-21表达降低，减轻炎症反应及细胞凋亡。相信随着基础医学的发展、miRNA研究的深入，OPCs治疗CIRI的作用机制将能得到更进一步的明确，这也为对脑缺血再灌注损伤的治疗提供进一步的理论依据。

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Protectiveeffectsandmechanismofpinebarkextractoncerebralischemiareperfusioninjuryinmice

YAO Qi1,2,YU Zi-jiang1*,SUN Bao-fei1

(1.Department of Anatomy,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China； 2.Department of ENT,The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550003)

ObjectiveTo investigate the role of IL-6/STAT3/miR-21 in the treatment of cerebral ischemia reperfusion injury in mice by pine bark extract.Methods120 KM mice were randomly divided into normal control group,sham operation group,14 d and 28 d model groups,14 d and 28 d treatment groups,each group with 20 mice.The model of cerebral ischemia-reperfusion injury model was made by bilateral common carotid artery occlusion.The mice in the treatment group were treated with pine bark extract procyanidins by intragastric administration for 7 days before the execution.The control group and sham operation group were treated with normal saline.The differences in learning and memory abilities and histopathological changes in the hippocampus of mice in each group were examined.The levels of interleukin 6,STAT3,p-STAT3 and miR-21 were measured.ResultsThe learning and memory abilities of the mice in the treatment group were higher than that in the model group at the same time points.The treatment group had less irregularity in the arrangement of Nissl body,irregular shape of the cells,with relatively lighter cytoplasmic staining,but was better than the model group.The expression level of IL-6 in the 28 d model group was lower than that in the 14 d model group,The IL-6 in the hippocampus of the treatment group was significantly lower than that in the model group at the same time point.There were no significant differences in the contents of total STAT3 protein in the hippocampus between the groups (P>0.05).The expression of p-STAT3 in the treatment group was lower than model group at the same time point.The expression of miR-21 in the hippocampus of 14 d,28 d treatment groups was lower than that in the model group at the same time point,and decreased with time.ConclusionsThe procyanidins extracted from pine bark may effectively inhibit IL-6,then the phosphorylation level of STAT3 is significantly decreased and finally decreases the expression of miR-21,so as to alleviate the cerebral ischemia reperfusion injury in mice.

Pine bark extract; Procyanidins; Ischemia reperfusion injury; Learning and memory; Mice

Yu Zi-jiang.E-mail: yzj0112@126.com

姚期(1982-)，男，本科，主治医师，主要从事耳鼻咽喉方面的研究。Email: yaoqi578@163.com

余资江(1968-)，男，博士，教授，主要从事神经损伤与修复方面的研究。Email: yzj0112@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 06-0632-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.008

2017-07-31