基于OPG-RANK-RANKL系统研究饲粮不同钙水平对生长期WHBE兔骨代谢的影响

吕建敏，蔡兆伟，蔡月琴，潘永明，刘军平，徐剑钦，黄俊杰

(浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州 310053)

研究报告

基于OPG-RANK-RANKL系统研究饲粮不同钙水平对生长期WHBE兔骨代谢的影响

吕建敏*，蔡兆伟，蔡月琴，潘永明，刘军平，徐剑钦，黄俊杰

(浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州 310053)

目的利用护骨素-核因子κB受体活化子-核因子κB受体活化子配体(OPG-RANK-RANKL)系统，探讨饲粮不同钙水平对生长期WHBE兔骨代谢影响。方法选择21只雄性断奶WHBE兔，随机分为3组(I、II、III组)，分别饲以钙水平为0.95%，1.10%和1.30%，其他营养水平基本一致的饲粮。实验期42 d。实验结束，测定兔血清钙(Ca)、甲状旁腺素(PTH)和骨源性碱性酶 (BALP)含量；分别运用荧光定量PCR法和免疫组织化学法对WHBE兔骨组织进行OPG-RANK-RANKL的基因转录和蛋白表达分析。最后以RANKL/OPG比值为指标，评估WHBE兔骨代谢与饲粮钙水平间的相关性。结果实验结果表明，I、II、III组在血清Ca、PTH含量和BALP活力上差异无显著性(P>0.05)。WHBE兔骨组织RANKL mRNA表达水平和RANKL/OPG mRNA比值均以II组最低，与I、III组差异有显著性(P<0.05)。钙水平对WHBE兔骨组织OPG-RANK-RANKL蛋白表达影响显著(P<0.01)，II组和III组OPG蛋白表达阳性指数均极显著高于I组(P<0.01)；而II组兔骨组织RANK蛋白表达阳性指数则极显著低于I组和III组(P<0.01)，RANKL/OPG的蛋白表达阳性指数比值以II组最低，与I组差异有显著性(P<0.01)。此外，WHBE兔骨组织RANKL/OPG mRNA比值和的蛋白表达阳性指数比值均与饲粮钙水平间存在显著的二次曲线相关(R2=0.4068,0.8433，P<0.05，P<0.001)。结论生长期WHBE兔的骨代谢与饲粮钙水平间呈显著相关性，当饲粮钙含量为1.10%时，生长期WHBE兔可获得较理想的骨代谢水平。

OPG-RANK-RANKL系统；钙；WHBE兔；骨代谢

钙是组成骨骼的重要成分，合理的饲粮钙水平对保证动物骨骼健康和维持正常骨量必不可少[1]。传统钙营养需要研究所采用的观察指标主要是动物的生长性能，营养物质消化率和钙代谢平衡等宏观指标[2]，不能精确反映钙的摄入对骨代谢水平的影响。护骨素(osteoprotegerin,OPG)-核因子κB受体活化子(receptor activator of NF-κB,RANK)-核因子κB受体活化子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)是近年发现的调节骨代谢的重要系统[3，4]，以RANKL与OPG比值来反映骨破坏程度[5]。虽然该系统目前在营养学研究中应用较少，但已广泛用于骨代谢疾病发病机制和药物疗效的研究[6-9]。另一方面，WHBE兔(白毛黑眼兔)是由浙江中医药大学动物实验研究中心培育的一种实验兔[10]，在前期育种和研究中发现，WHBE兔容易发生自发性前肢畸形，且与日本大耳白兔相比，其血清Ca和ALP水平较低[11]，骨组织RANK mRNA的表达水平较高[8]。为进一步探明WHBE兔骨代谢与饲粮钙水平的相关性，本研究利用OPG-RANK-RANKL系统，辅以血清骨代谢指标，探讨不同钙水平对生长期WHBE兔骨代谢的影响，旨在为更合理制定WHBE兔钙营养标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

42日龄，体重1.2～1.4 kg的雄性WHBE兔21只，购自浙江省新昌县大市聚镇欣健兔场【SCXK(浙)2015-0042】，饲养实验在浙江中药大学动物实验研究中心进行【SYXK(浙)2013-0184】，温度：24℃，相对湿度：70%，光照：12 h明/12 h暗。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 试剂与仪器

7020型全自动生化分析仪(日本日立公司)、Model 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；iQ-5荧光定量PCR仪、水平电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Nanodrop 2000蛋白核酸测定仪(美国Thermo公司)；9700 PCR扩增仪(美国ABI公司)，Micromap-280组织包埋机、MICROM HM-335E型轮转切片机(德国Microm公司)；Leica染色机(瑞士Leica公司)，NanoZoomer-2.0RS数字切片扫描仪(日本滨松光电)。

钙生化检测试剂盒(南京建成生物公司)、兔甲状旁腺素(PTH)、兔骨源性碱性磷酸酶(BALP)ELISA 试剂盒(杭州诚维生物公司)。RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒和SYBR Green 荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物公司；OPG、RNAK、RANKL及内参β-actin引物(生工生物工程(上海)有限公司合成)。RANK兔多抗(博奥森公司)；RANKL鼠单抗和OPG兔多抗(Abcam公司)。

1.2 实验方法

采用单因子实验设计，参考现行的实验兔钙营养国家标准[12](1.0%～1.5%)，设计3种不同钙水平(钙磷比)的等磷饲粮，即钙含量(按实测值计)分别为0.95%，1.10%和1.30%，而其他营养成分保持一致。具体配方和营养水平见表1。按采食上述饲粮的钙水平由低到高随机分为I、II、III组，每组7个重复。实验期42 d。试兔单笼饲养，早、中、晚各喂饲粮1次，自由饮水，并定期清洁更换笼具。

表1 实验饲粮组成及营养水平(风干基础)/%Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diets (air-dry basis)

注:预混料可为每千克饲粮提供: VA 6000 IU，VE 40 IU,VD 1000 IU,VB110 mg,VB215 mg,VB640 mg,烟酸 60 mg,泛酸 20 mg,叶酸4 mg,生物素1 mg,胆碱 1000 mg。锌 (以ZnSO4形式) 40 mg，碘 (以KI形式) 0.26 mg，镁 (以MgSO4形式) 3.2 mg，铁 (以FeSO4形式) 160 mg，锰 (以MnSO4形式) 65 mg，K (以K2SO4形式) 15 mg，食盐5 g。磷酸氢钙(I-III组)8 g、7.72 g、10 g，石粉(I-III组)5 g、9.24 g、15 g。钙、总磷为实测值，其余为计算值。
Note.The premix provided the following ingredients per kg of diets: VA 6000 IU,VE 40 IU,VD 1000 IU,VB110 mg,VB215 mg,VB640 mg,niacin 60 mg,pantothenic acid 20 mg,folic acid 4 mg,biotin 1 mg,choline 1000 mg.Zn (as zinc sulfate) 40 mg,I (as potassium iodide) 0.26 mg,Mg (as magnesium sulfate) 3.2 mg,Fe (as ferrous sulfate) 160 mg,Mn (as manganous sulfate) 65 mg,K (as potassium sulfate) 15 mg,NaCl 5 g.CaHPO4(I-III groups)8 g,7.72 g,10 g,limestone(groups I-III)5 g,9.24 g,15 g.Ca and TP were measured values,others were calculated values.

1.3 检测指标

1.3.1 样本采集

实验结束，取血，分离血清，-20℃冰箱保存。麻醉处死各组受试兔，取右侧前肢骨(尺桡部)，去除表面附着筋膜及软组织，PBS冲洗，入液氮急冻，-80℃冰箱保存；取左侧前肢骨(尺桡部)于4%中性甲醛中固定。

1.3.2 兔血清骨代谢指标检测

采用钙生化检测试剂盒测定血清钙(Ca)含量。利用酶联免疫法，测定血清甲状旁腺素(PTH)含量和骨源性碱性磷酸酶(BALP)活力，具体方法参见相应的试剂盒说明书。

1.3.3 兔前肢骨组织OPG、RANK、RANKL mRNA荧光定量PCR检测

将骨组织样本放入研砵，加入液氮急速研磨，磨碎后骨组织先进行总RNA提取和检测， 再进行cDNA合成，最后利用合成的cDNA为模板进行OPG、RANK、RANKL荧光定量PCR检测。采用2-ΔΔCT计算差异基因转录水平。具体检测方法参见文献[8]。OPG、RANK、RANKL及内参β-actin引物序列见表2。

表2 OPG、RANK、RANKL 及内参(β-actin)引物序列及相应产物长度Tab.2 The primers and length of PCR products of OPG,RANK,RANKL and β-actin

1.3.4 兔前肢骨组织OPG-RANK-RANKL蛋白表达

按文献[8]的方法，先将兔前肢骨固定、脱钙、石蜡包埋，再将石蜡包埋块切片、脱蜡，进行HE染色和免疫组织化学染色，最后用数字切片扫描仪和图像分析软件(Carl Zeiss Imaging Systems：Carl Zeiss公司)对每张制作好切片进行图像扫描和分析。OPG、RANK和RANKL蛋白的表达强度以阳性指数表示。

1.4 统计学方法

采用SAS统计软件(8.1)广义线性模型(GLM)进行单因素方差分析和显著性比较，实验数据用平均数表示，P>0.05为差异无显著性，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有显著性，组间样本均数差异采用Duncan氏多重比较检验。依据正交多项式分析(Orthogonal polynomial contrasts)，比较各参数随饲粮钙水平增加而变化的线性(Line,L)和二次性(quadratic,Q)变化趋势。

2 结果

2.1 生长期WHBE兔血清骨代谢指标

日粮钙水平对生长期WHBE兔血清骨代谢指标的影响见表3。由表3可见，血清Ca、PTH、BALP等指标在各组间差异均无显著性(P>0.05)。

表3 日粮钙水平对生长期WHBE兔血清骨代谢指标的影响Tab.3 Effects of dietary Ca on serum indices of bone metabolism of WHBE rabbits during growing periods

注：同列无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。
Note.In the same column,values with no letter or the same letter superscripts mean nonsignificant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).The same as below.

2.2 生长期WHBE兔骨组织OPG-RANK-RANKL mRNA表达

饲粮钙水平对WHBE兔骨组织OPG-RANK-RANKL mRNA表达的影响结果见表4。由表4可见，饲粮钙水平对WHBE兔骨组织OPG和RANK的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05)，而II组的RANKL mRNA表达水平及RANKL与OPG的mRNA表达水平比值均显著低于I、III组(P<0.05)；且RANKL/OPG mRNA比值与饲粮钙水平间呈显著二次曲线相关(P<0.05)。

2.3 生长期WHBE兔骨组织形态和OPG-RANK-RANKL蛋白表达

2.3.1 骨组织形态观察

各组兔桡骨组织石蜡切片HE染色观察结果见图1，由图1可见， II组兔的骨皮质部位紧致度优于I组和III组。

图1 生长期WHBE兔桡骨石蜡切片HE 染色结果(×50)Fig.1 Comparison of bone histology of the WHBE rabbits during growing periods

2.3.2 骨组织OPG-RANK-RANKL蛋白表达

生长期WHBE兔骨组织OPG、RANK和RANKL蛋白的免疫组化染色图片见图2。OPG、RANK和RANKL蛋白表达的阳性指数见表4。OPG、RANK、RANKL蛋白在骨细胞胞质和胞核中均有表达(图2)。由表4可见， II组和III组OPG蛋白表达阳性指数均极显著高于I组(P<0.01)；RANK蛋白表达阳性指数以II组最低，与I组和III组相比差异均有显著性(P<0.01)，RANKL蛋白表达阳性指数也以II组最低，与I组相比差异有显著性(P<0.01)。此外， OPG、RANK和RANKL蛋白表达阳性指数及RANKL/OPG比值等指标均与饲粮钙水平间存在显著二次曲线相关(P<0.05，P<0.001，P<0.01，P<0.001)。

3 讨论

血清钙(Ca)、甲状旁腺素(PTH)、骨源性碱性磷酸酶 (BALP)是反映骨代谢的重要指标，特别是在监测钙营养不良时起到重要作用。钙营养不良能促使PTH上升，促进肾脏合成 1,25 (OH)2VD3生成，进而使静止的成骨细胞转变为活跃的成骨细胞，合成大量的 BALP释放进入血液[13]。BALP在骨钙沉积不足时会升高，因此该酶可用来评价骨骼中钙吸收和沉积的情况[14]。而在本实验中，WHBE兔血清Ca、PHT、BALP等指标在0.95%、1.10%和1.30%饲粮钙水平下均无显著差异，分析原因，一是0.95%～1.30%钙水平在国家标准要求范围内[12]，不致于使生长期WHBE兔钙营养缺乏，另一方面0.95%～1.30%钙水平变化范围范较窄，不足以引起上述指标发生明显变化，因此需要用更敏感的指标进行研究。

图2 生长期WHBE兔桡骨OPG、RANK和RANKL蛋白免疫组织化学染色(×100)Fig.2 Expression of OPG,RANK and RANKL in radius tissues of the WHBE rabbit during growing periods (Immunohistochemical staining)

表4 饲粮钙水平对生长期WHBE兔骨组织OPG-RANK-RANKL蛋白表达阳性指数及RANKL/OPG比值的影响Tab.4 Effects of dietary Ca on OPG-RANK-RANKL protein expressions and RANKL/OPG ratio of bone tissues in the WHBE rabbits during growing period

OPG-RANK-RANKL系统是近年来发现的调节骨代谢的信号系统，其作用主要体现在对破骨细胞的调控[4]： RANKL与RANK结合形成RANK-RANKL信号，可激活下游信号分子，促进破骨细胞分化、成熟，增强骨的吸收[15]；而OPG可与RANKL竞争性结合，能效抑制骨吸收[16]。OPG、RANK、RANKL三者间应保持一定比率，一旦比率失衡，就可能引起骨代谢紊乱[17]，故常把RANKL/OPG比值作为衡量骨代谢状况的关键因子[5]。虽然OPG-PANK-RANKL系统用于营养学研究的报道甚少，但已有的报道显示该系统可较灵敏反映营养素与骨代谢之间的关系。如Fatemeh等在大鼠饲粮中联合补充钙、VD和雌激素，显著增加了大鼠血清OPG含量，降低了RANKL含量，增强了骨密度[18]； Katsumataa等[19]研究发现高磷日粮可显著提高大鼠股骨中RANKL mRNA的表达，导致骨量的大量丢失。Dan等[20]发现适量的锌可使细胞内OPG基因和蛋白的表达显著提高。

本实验尝试将OPG-RANK-RANKL系统用于WHBE兔钙营养需要研究，发现生长期WHBE兔骨组织RANKL mRNA和RANKL/OPG 的mRNA比值均在饲粮钙水平为1.10%时显著降低，且后者与饲粮钙水平间呈显著二次曲线相关； 骨组织RANKL蛋白表达阳性指数和RANKL与OPG的蛋白表达强度比值也均以II组最低，蛋白表达强度RANKL/OPG比值也与饲粮钙水平显著相关。从以上结果看出，生长期WHBE兔的饲粮钙适宜水平大致为1.10%，但其最佳值还有待后续通过建立回归方程确定。本试验同时说明OPG-RANK-RANKL系统在评估实验兔钙营养需要上较血清Ca、PTH、BALP等指标敏感，因此，将OPG-PANK-RANKL系统作为主要参数来研究骨代谢与营养素之间的相关性，不失为骨骼发育营养学的研究的一种途径。

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EffectsofdifferentdietarycalciumlevelsonthebonemetabolismingrowingWHBErabbitsviaOPG-RANK-RANKLsystems

LYU Jian-min*,CAI Zhao-wei,CAI Yue-qin,PAN Yong-min,LIU Jun-ping,XU Jian-qin,HUANG Jun-jie

(Laboratory Animal Research Center,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

ObjectiveThe study was carried out to investigate the effects of different dietary Ca levels on bone metabolism,based on the osteoprotegerin (OPG)-receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)-receptor activator of NF-κB (RANK) system in growing WHBE rabbits.MethodsTwenty one weaned male WHBE rabbits at the age of 42 days were divided into 3 groups (I,II and III) according to dietary Ca levels (0.95%,1.10%,and 1.30%,respectively) for a 42-d feeding trial.The above three diets had similar phosphor (P) (about 0.64 g/kg),digestible energy (9.50 MJ/kg),crude protein (about 19.70%) and crude fibre (13.57%) contents.When the feeding trial finished,the serum indices of bone metabolism (Ca,PTH and BALP) were detected,and the OPG-RANK-RANKL system in bone tissue was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR assay and immunohistochemistry,respectively.At last,the relationships between bone metabolism and dietary Ca were evaluated according to RANKL/OPG ratio.ResultsAll the contents of serum Ca,PTH and BALP had no significant differences in the groups I,II and III (P>0.05).Both the RANKL mRNA and RANKL/OPG mRNA ratio were lowest in the group II and had significant differences with group I and III (P<0.05).Dietary Ca levels had significant effects on the protein expression of OPG-RANK-RANKL in bone tissues (P<0.01).The positive index of OPG in the groups II and III was significantly higher than that in the group I(P<0.01),while the positive index of RANK in the group II was lower than those of the group I and III(P<0.01).The protein expression positive index ratio of RANKL to OPG was also lowest in the group II,showing a significant difference with group I(P<0.01).Furthermore,both the gene transcription ratio of RANKL to OPG and the protein expression positive index ratio of RANKL to OPG had significant correlations (with quadratic curve) to the dietary Ca levels (R2=0.4068,0.8433;P<0.05，P<0.001).ConclusionsIn summary,the bone metabolism of WHBE rabbits during growing periods has significant correlation with dietary Ca levels.An optimal bone metabolism status can be obtain at 1.10% dietary Ca level as demonstrated in this study.

OPG-RANK-RANKL system; Calcium; WHBE rabbit; Bone metabolism

LYU Jian-min.E-mail: ljm6666@163.com

浙江省科技厅资助项目基金(No.2014C37008)；浙江中医药大学比较医学创新团队基金(No.XTD201301)。

吕建敏(1971年-)，女，，博士，研究员，研究方向：实验动物动物营养。E-mail: ljm6666@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 06-0618-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.006

2017-05-09