聚羟基丁酸酯/聚乙二醇纳米复合支架的生物相容性研究

王译婕，王 洁，万婉婷，杜婵媛，白乐康，邹 蕊

(1.西安交通大学口腔医学院陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室 陕西 西安 710004；2.西安交通大学口腔医学院口腔正畸科 陕西 西安 710004；3.陕西中医药大学附属医院 陕西 咸阳 712000；4.西安交通大学口腔医学院口腔修复科 陕西 西安 710004)

聚羟基丁酸酯/聚乙二醇纳米复合支架的生物相容性研究

王译婕1,2，王 洁3，万婉婷1,2，杜婵媛1,2，白乐康4，邹 蕊1,2

(1.西安交通大学口腔医学院陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室 陕西 西安 710004；2.西安交通大学口腔医学院口腔正畸科 陕西 西安 710004；3.陕西中医药大学附属医院 陕西 咸阳 712000；4.西安交通大学口腔医学院口腔修复科 陕西 西安 710004)

目的：采用聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)/聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)纳米复合生物材料构建三维培养支架并与大鼠髁突软骨细胞(condylar chondrocytes)复合培养，评价其生物相容性。方法：应用静电纺丝法制备PHB/PEG纳米复合生物支架，将大鼠髁突软骨细胞接种于PHB/PEG支架上，分别于复合培养4h，72h时利用荧光显微镜及扫描电子显微镜观察细胞在三维支架上的粘附、铺展及生长情况，并应用MTT四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞的增殖活性，评价其生物相容性。结果：荧光显微镜及扫描电子显微镜观察显示复合培养4h时细胞已粘附于支架表面，部分细胞开始铺展，培养72h细胞在支架表面增殖及生长良好，MTT结果显示PHB/PEG纳米三维支架复合培养大鼠髁突软骨细胞较对照组具有更高的增殖活性。结论：静电纺丝法制备的PHB/PEG纳米复合生物支架可以促进大鼠髁突软骨细胞的粘附、生长和增殖，具有良好生物相容性，为组织工程软骨再生奠定一定的实验基础。

髁突软骨细胞；PHB/PEG纳米支架；复合培养；生物相容性

髁突软骨是口腔颞下颌关节的重要结构，是一种特化的、具有负重功能的结缔组织，也是下颌骨主要生长中心之一，可承受机械振荡刺激并将该刺激均匀传递至下方区域的骨组织[1]。正常范围的力学刺激有助于维持关节软骨结构和功能的完整性，髁突软骨作为一种继发性软骨，其发育后的继续生长与功能负荷密切相关，而这一生物学特性是口腔正畸功能矫形及修复咬合重建治疗的基础[2-3]。髁突软骨细胞是关节软骨的主要功能成分，为了维持体外培养细胞表型以及生物学特性稳定，选择合适的支架材料对其进行三维培养成为目前国内外的研究热点。众所周知，生理性应力对细胞的作用是通过改变细胞生长的三维微环境而实现的，细胞外基质微环境的空间物理结构显著影响细胞增殖分化及功能表达[4-5]。传统二维培养模式下细胞无重叠的分布方式在很大程度上简化和忽略了力学信号转导过程中细胞间、细胞和细胞外基质间的协同作用及相互依赖性，并不能在体外精准模拟在体组织三维空间环境变化。随着实验方法的改进及研究内容的不断深化，细胞力学实验已逐渐由早期二维细胞力学实验向生物支架复合细胞三维力学加载过渡[6-7]，从而获得与在体情况更加接近的体外细胞力学实验模型，以期更加接近临床问题的力学实质。本研究应用静电纺丝法构建三维力学加载支架，并与大鼠髁突软骨细胞复合培养，研究PHB/PEG三维支架的生物相容性，为最终揭示三维培养细胞的力学信号转导机制及构建组织工程髁突软骨提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物：SD乳鼠12只，出生后3～5d，雌雄不限(西安交通大学医学院动物医学中心提供)。

1.2 实验试剂：高糖DMEM培养基(Gibco Co,USA)；胎牛血清(Gibco Co,USA)；青链霉素(Gibco Co,USA)，Ⅱ型胶原酶(Gibco Co,USA)；0.25％胰蛋白酶(Gibco Co,USA)；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma,USA)；孔板(Coning,USA)；细胞培养皿(Coning,USA)；PBA液，PBS液等自行配制。

1.3 仪器和设备：扫描电子显微镜(Hitachi，TM-1000)；酶联免疫检测仪(Bio-Rad公司)；倒置相差显微镜及照相系统(OLYMPUS FSX100)。

1.4 实验方法

1.4.1 PHB/PEG三维生物支架的制备：将2.7g PHB、0.3g PEG溶解于45ml三氯甲烷并磁力搅拌12h使其充分溶解，再与5ml二甲基甲酰胺(DMF)混合均匀制备PHB/PEG纺丝溶液。利用自组建的静电纺丝设备，以15kV电压将PHB/PEG纺丝溶液以1.2ml/h的流速喷射出形成纺丝纤维。喷丝头方向垂直于接收屏，且喷丝头和接收屏之间纺丝距离约15cm，静电纺丝时间大约1h，从而制得薄膜状的多孔三维立体的支架材料。

1.4.2 髁突软骨细胞培养及生物学鉴定：选择出生3～5d的大鼠乳鼠进行髁突软骨细胞的原代培养，取第三代髁突软骨细胞行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色。

1.4.3 大鼠髁突软骨细胞在PHB/PEG支架上的接种培养：取第三代大鼠髁突软骨细胞加2ml 0.25％胰蛋白酶37℃消化2～3min，以生长培养基终止消化，稀释后反复吹打成细胞悬液，以l×l05/ml密度接种于24孔板内的PHB/PEG支架上，每孔1ml，复合培养。

1.4.4 复合培养细胞荧光显微镜观察：4h、72h后将上述复合培养的PHB膜从孔板中取出，置于载玻片上，滴加荧光染色剂，立即于荧光倒置相差显微镜下观察。

1.4.5 复合培养细胞扫描电镜观察：4h、72h后将上述复合培养PHB膜从孔板中取出，固定，室温过夜，送检、制样、观察。

1.4.6 MTT比色法检测大鼠髁突软骨细胞的增殖生长状态：将上述复合培养细胞及相同条件下的细胞培养板上的髁突软骨细胞，分别培养ld、3d、5d、7d后每孔加入MTT溶液(5mg/ml)100μl，37℃环境下孵育4h。将孔内液体吸出，每孔加入600μl 二甲基亚砜(DMSO)，即出现蓝紫色产物，振荡10min，使甲瓒充分溶解。吸出蓝紫色液体后，将其加入96孔板，实验组和对照组各选3孔，每孔200μl。在酶联免疫检测仪上选择490nm波长，测定各孔吸收值，记录结果，以时间(d)为横轴，光吸收值(OD值)为纵轴绘制细胞生长曲线，设空白对照。

通过以上方法与普通单层方法培养细胞进行对比，分析PHB/PEG复合纳米纤维支架材料的细胞相容性。

1.5 统计学分析：采用SPSS 19.0软件包，对MTT结果重复测量数据行方差分析。

2 结果

2.1 大鼠髁突软骨细胞的生物学特性鉴定结果：第三代软骨细胞甲苯胺蓝染色观察，绝大部分呈多角形，胞浆内呈紫红色异染颗粒，细胞周围有少量异染颗粒出现(图1A)；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性结果，胞浆被染成棕黄色(图1B)。

2.2 荧光染色法观察细胞在三维支架上的生长：将大鼠髁突软骨细胞与PHB/PEG三维生物支架复合培养4h荧光染色，荧光显微镜下清晰可见亮染细胞核分布于支架表面及支架之间，部分细胞已开始铺展；72h镜下可见细胞明显铺展生长，细胞核亮染而且数目明显增多，细胞开始分裂增殖(图2)。

图2 荧光显微镜下细胞支架复合培养结果

2.3 扫描电镜(SEM)观察细胞在支架复合体上的生长状态：大鼠髁突软骨细胞与PHB/PEG三维生物支架复合培养4h，扫描镜下观察可见，PHB/PEG三维支架表面及支架内上散在大量的髁突软骨细胞(图3A)，多数细胞开始粘附在支架表面呈球状，有部分细胞开始伸出伪足(图3B)。复合培养72h，整个PHB/PEG支架表面可见密集排列的细胞，与培养4h相比，细胞数量明显增多，并已在支架表面增殖、铺展，相互重叠(图3C)。高倍镜下可见细胞开始跨越多孔结构的支架孔隙和间隔，覆盖于支架材料表面。有些地方可见增生的髁突软骨细胞几乎完全包裹纤维支架，有部分细胞伪足伸入支架孔隙内部生长(图3D)。

图3 扫描电子显微镜下髁突软骨细胞与PHB/PEG支架复合培养

2.4 细胞增殖活性检测结果：MTT结果表明(图4)：实验组与对照组的大鼠髁突软骨细胞随着培养时间的延长而增殖。细胞接种第1天，可见两组的髁突软骨细胞OD值均较低，细胞逐步开始增殖生长；细胞接种第3天，两组的细胞数量均增高，OD值明显高于第一天，但两组之间未出现显著性差异；细胞接种第5天，PHB/PEG支架复合培养细胞增殖活力明显增高，对照组细胞增殖活力虽有增长，但显著低于实验组；细胞接种第7天，PHB/PEG支架组细胞增殖活力仍呈现上升趋势，对照组与第5天相比同样有少量增加，可见增长曲线放缓。PHB/PEG支架复合培养组细胞增殖活性显著高于对照组。

图4 细胞增殖活性检测结果

3 讨论

聚-β-羟基丁酸酯(PHB)作为聚羟基脂肪酸酯(PHAs)家族中的一员，由于其优良的生物相容性和生物可降解性，在生物医学领域得到了广泛应用[8-9]。PHB材料制成的多孔支架材料，具有可支撑各种细胞存活的三维空间结构，能够嵌入或携带细胞，并提供良好的细胞生长环境[10]。通过调整支架材料的孔隙率及孔径大小，可适应培养多种细胞的要求。但PHB材料表面呈现较高的疏水性和生物惰性，材料本身强度欠佳。聚乙二醇(PEG)是一种水溶性的高聚物，同时又是完全可降解材料，无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，与许多有机物有良好的相容性[11-12]。聚乙二醇(PEG)的引入，可显著促进PHB材料的生物活性并提高其机械强度。

细胞外基质的三维结构是细胞的生长和分化所依赖的微环境，同时也是细胞内信号传递和化学反应的起始者，可参与调控细胞分化及各种其他功能活动。越来越多的实验证据证明，只有生长在三维基质微观环境中，细胞形态才更接近在体细胞[13]。同时，细胞形态、细胞骨架结构和细胞外基质的相互作用与细胞的代谢过程密切相关[14]。近年来组织工程技术的飞快发展，为构建细胞的体外三维生长环境提供了可能。理想的组织工程支架材料应具备高度仿生的微观形态结构，即具备适当的孔隙率、充分的表面积和适宜的表面化学，从而促进细胞的黏附、生长、增殖和分化。目前，已有多种技术可用于制备满足以上要求的支架材料，而静电纺丝技术能够制造出直径达纳米级的连续纤维[15]，引起了学者们的广泛关注。因此本实验利用静电纺丝技术，选用PHB/PEG复合生物材料制作髁突软骨细胞类胞外基质微环境支架，为研究力学刺激下髁突软骨细胞的生物学行为变化奠定微观结构基础。

良好的生物相容性是生物支架材料的重要性能之一。本实验将大鼠髁突软骨细胞与PHB/PEG纳米复合生物支架进行复合培养，并进行形态学观察及细胞增殖活性检测，初步证实了PHB/PEG纤维支架材料有利于细胞的粘附、生长、增殖，具有良好的细胞生物相容性。荧光染色及扫描电镜观察从定性的角度表征了支架良好的生物相容性，细胞在接种4h粘附于支架表面并开始铺展，而接种72h细胞的增殖显著增加，并呈现出三维生长。MTT结果从定量的角度评价了大鼠髁突软骨细胞与PHB/PEG支架材料复合培养不同时间点细胞的增殖情况。检测结果显示，培养前3d，与对照组相比，PHB/PEG支架上复合培养的大鼠髁突软骨细胞数量虽略有增加，但二者未出现显著差异；培养5～7d后，PHB/PEG复合纤维支架上复合培养的大鼠髁突软骨细胞增殖活性明显高于对照组。由此可见，静电纺丝技术制备的PHB/PEG纤维支架材料对大鼠髁突软骨细胞的粘附、生长、增殖具有一定的促进作用，具有良好的生物相容性，并可为细胞生长提供良好的微观结构，可为进一步研究力学刺激诱导髁突软骨损伤修复及再生重建提供新的组织工程材料。

[1]Murphy MK,MacBarb RF,Wong ME,et al.Temporomandibular disorders: a review of etiology,clinical management,and tissue engineering strategies[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2013,28(6):393-414.

[2]Xie Q,Li X,Xu X.The difficult relationship between occlusal interferences and temporomandibular disorder - insights from animal and human experimental studies[J].J Oral Rehabil,2013,40(4): 279-295.

[3]Peck CC.Biomechanics of occlusion--implications for oral rehabilitation[J].J Oral Rehabil,2016,43(3):205-214.

[4]Swinehart IT,Badylak SF.Extracellular matrix bioscaffolds in tissue remodeling and morphogenesis[J].Dev Dyn,2016,245(3):351-360.

[5]Brown BN,Badylak SF.Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction[J].Transl Res,2014,163(4):268-285.

[6]Zhang WJ,Zhang A,Gu P,et al.A review of the three-dimensional cell culture technique: approaches,advantages and applications[J].Curr Stem Cell Res Ther,2016,11(4):370-380.

[7]Maddaly R,Paramesh V,Kaviya SR.3D cell culture systems:advantages and applications[J].J Cell Physiol,2015,230(1):16-26.

[8]Prabisha TP,Sindhu R,Binod P,et al.Production and characterization of PHB from a novel isolate Comamonas sp. from a dairy effluent sample and its application in cell culture[J].Biochem Eng J,2015,101(2):150-159.

[9]Chang HM,Wang ZH,Luo HN,et al.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)-based scaffolds for tissue engineering[J].Braz J Med Biol Res,2014,47(7):533-539.

[10] Ray S,Kalia VC. Biomedical Applications of Polyhydroxyalkanoates[J].Indian J Microbiol,2017,57(3): 261-269.

[11]Chan RT,Marcal H,Ahmed T,et al.Poly(ethylene glycol)-modulated cellular biocompatibility of polyhydroxyalkanoate films[J].Polym Int,2013,62(6):884-892.

[12]Pandian SRK,Deepak V,Nellaiah H,et al.PEG-PHB-glutaminase nanoparticle inhibits cancer cell proliferation in vitro through glutamine deprivation[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2015,51(4):372-380.

[13]邹蕊,宋锦璘,牛林.不同方法制备的PLGA-胶原复合支架对大鼠成肌细胞增殖活性的影响[J].山西医科大学学报,2012,43(8):578-580.

[14]Grinnell F,Petroll WM.Cell motility and mechanics in threedimensional collagen matrices[J]. Annu Rev Cell Dev Biol,2010,26:335-361.

[15]Sun B,Long YZ,Zhang HD,et al.Advances in three-dimensional nanofibrous macrostructures via electrospinning[J].Prog Polym Sci,2014,39(5):862-890.

The Biocompatibility Study on Polyhydroxybutyrate/Polyethylene Glycol Nanocomposite Scaffolds

WANG Yi-jie1,2,WANG Jie3,WAN Wan-ting1,2,DU Chan-yuan1,2,BAI Le-kang4,ZOU Rui1,2
(1.Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University ,Xi'an 710004,Shaanxi,China;2.Department of Orthodontics,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China;3.Af fi liated hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,China;4.Department of Prosthodontics,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China)

Objective Three-dimensional nano composite biological scaffolds were prepared using polyhydroxybutyrate (PHB)/polyethylene glycol(PEG) and compound culture with rat condylar cartilages,to evaluate its biocompatibility.Methods The PHB/PEG nano composite biological scaffolds were prepared by electrospinning and the rat condylar cartilages were seeded in it. The adhesion,growth and spreading of cells were observed by fl uorescence microscope and scanning electron microscope after seeding 4h and 72h,and evaluated cells’ proliferation and scaffold biocompatibility using MTT.Results From the results of fl uorescence microscope and scanning electron microscope,cells adhere on the scaffolds completely and some cells began spreading after 4h,the proliferation and growth were better after 72h. The results of MTT showed that PHB/PEG nanocomposite scaffolds can promote proliferation of rat condylar cartilages.Conclusion The PHB/PEG nanocomposite biological scaffolds have good biocompatibility and can promote adhesion,growth and proliferation of rat condylar cartilages,which will establish on experimental basis for tissue engineering cartilage regeneration.

condylar cartilages; PHB/PEG nano scaffolds; compound culture; biocompatibility

R318.08

A

1008-6455(2017)11-0059-04

国家自然科学基金(81300915)；陕西省自然科学基础研究计划(2015JM8414)

邹蕊，西安交通大学口腔医院正畸科，副教授，副主任医师，硕士生导师，科教科副科长；长期从事错牙合畸形的临床矫治、颌面部组织再生与修复、口腔生物力学等临床及科研工作； E-mail:rainy@mail.xjtu.edu.cn

2017-09-14

2017-10-13

编辑/朱婉蓉