人胎盘间充质干细胞条件培养基对急性缺血再灌注肾损伤的修复作用

汪 娟,潘勇军，张 杰

·论 著·

人胎盘间充质干细胞条件培养基对急性缺血再灌注肾损伤的修复作用

汪 娟,潘勇军，张 杰

目的观察尾静脉注射人胎盘间充质干细胞条件培养基(human placenta-mesenchymal stem cell conditional medium,MSCs-CM)对急性缺血再灌注肾损伤(acute renal ischemia reperfusion injury，IR)的修复作用。方法健康雄性SD大鼠(n=30)分为3组：空白对照组(sham组)，模型组(IR组)和治疗组(IR+MSCs组),每组10只。制备大鼠缺血再灌注肾损伤模型，建模24h后以尾静脉注射MSCs条件培养基，并连续跟踪4d监测血清及尿液的肌酐含量，随后取肾脏组织行过碘酸雪夫反应(PAS)染色检查观察肾脏损伤及修复状况；经2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)法检测肾组织内活性氧含量；Western Blot法检测肾脏组织内血红素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)及磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1(NAPDH quinineoxidoreductase-1，NQO-1)的相对表达水平。结果模型组大鼠的血、尿肌酐含量相对于空白正常组明显升高，出现肾损伤；而治疗组大鼠的血、尿肌酐含量与IR组相比有明显改善且与Sham组指标相似；PAS染色观察显示，模型组大鼠存在肾小管损伤，而治疗组大鼠肾小管损伤明显轻于模型组；Western blot分析显示治疗组细胞抗氧化标志物NQO-1和HO-1的蛋白表达水平显著高于模型组(P<0.05)。结论MSCs-CM经尾静脉移植后，对缺血再灌注所致的肾损伤具有明显的修复作用，其修复肾脏损伤机制可能与抗氧化应激有关。

肾损伤； 干细胞； 培养基； 缺血灌注

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床中常见的高发病率、高病死率的疾病。肾缺血再灌注损伤(acute renal ischemia reperfusion injury，IRI)是AKI 发生的主要病因之一，其病理改变为急性肾小管上皮细胞凋亡和坏死[1-2]。临床上，对AKI的处理一直停留在肾脏替代治疗和支持治疗水平，急性期高病死率和后期演变为慢性肾脏疾病的现象多年来未得到改善。近年间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤成为研究热点，间充质干细胞具有增殖分化能力，研究表明间充质干细胞可以分泌多种细胞因子，这些细胞因子在调节炎症反应、参与修复损伤、抑制细胞凋亡等方面起到重要作用。目前已有研究表明间充质干细胞可以改善肾脏缺血再灌注所致的肾损伤[3-4]，然而间充质干细胞移植也存在一定的问题，如间充质干细胞能否持续性生存在损伤环境中、如何解决归巢率低等问题。

本实验利用间充质干细胞可以通过旁分泌途径对肾脏损伤起到保护和治疗作用的特性，拟通过人胎盘血间充质干细胞条件培养基的制备，利用条件培养基来治疗肾缺血再灌注损伤，观察缺血再灌注的肾脏功能恢复情况，以证明胎盘间充质干细胞条件培养基对大鼠肾脏IR损伤有修复作用，期望为临床治疗提供新的思路和实验依据。

材料与方法

1材料

1.1动物模型 动物模型：雄性SD大鼠(购于武汉大学动物中心)共30只，体重200g左右，按照随机分配的原则进行分组：正常组(Sham组) 、模型组(IR组)和治疗组(IR+MSCs组)。

1.2主要试剂 低糖-DMEM、EDTA-胰蛋白酶、胎牛血清、血红素氧化酶-1(HO-1)及磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1(NQO-1)抗体及流式细胞仪检测表面标记的所有抗体全部购自Sigma公司。

2人胎盘间充质细胞条件培养基的制备

健康产妇(无艾滋病、梅毒、乙型肝炎、丙型肝炎及其他传染性疾病，无病理妊娠)获得知情同意。在无菌条件下收集足月正常分娩的胎盘，采用贴壁培养法分离胎盘间充质干细胞，胎盘间充质干细胞传代到第3代，通过倒置显微镜观察细胞贴壁良好、融合度达80%时，经流式细胞仪检测细胞表型鉴定，更换无血清培养基，24h后收集培养上清液，离心3 000g/10min，收集上清(在显微镜下观察是否有细胞及碎片)即为人胎盘带间充质干细胞条件培养基，分装后-80℃储存。

3IR建模与注射

术前12h对大鼠禁食，2%戊巴比妥(40mg/kg)麻醉，取腹部正中切口，逐层分离皮肤、皮下组织、腹膜，然后进入腹腔，找到肾蒂，用无创性动脉夹迅速夹闭双侧肾蒂，1h后去掉动脉夹，让血流恢复灌注。空白对照组只进行剖腹。造模后24h,治疗组大鼠尾静脉注射1mL间充质干细胞条件培养基，模型组及空白对照组在相同时间点每只大鼠注射1mL无血清低糖-DMEM培养基。

4标本的收集与检测

造模后每隔24h如潘景业等[5]所述方法剪尾取血0.1mL，4℃，3 000rpm/min离心，取上清液。取24h尿液，并记录体积。以全自动生化检测仪检测血清肌酐(blood creatinine,B-Cr)及尿液肌酐(urine creatinine,U-Cr)，连续收集并检测4d，随后处死大鼠，取肾脏组织进行过碘酸雪夫反应(PAS)染色，并采取Millar[8]法评分。

5肾脏组织损伤形态学评分

在放大倍数200X显微镜下观察大鼠肾脏组织病理性变化，根据细胞坏死、肾上皮细胞刷状缘破坏丢失、空泡化和肾小管扩张等情况对各组大鼠肾脏组织进行评分，每个大鼠取2张切片，每张切片至少20个连续视野，采取双盲法分别由研究人员和病理医师对肾脏组织进行评分，取双方评分的平均值作为衡量肾小管损伤的指标。

6肾脏组织内活性氧水平的测定

2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)法：将肾脏组织称重，按1∶20的比例置于4℃的的平衡缓冲液中匀浆得到5mg/mL的混合液，12 000rpm/min 离心，取上清液上全自动酶标仪检测荧光值(488nm),得到荧光值后以空白对照组的数值为基准，其他组数值与其的比值即为组织内相对活性氧水平。

7Western blot分析

取等量的肾脏蛋白提取物(100μg)上样，10%聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。电泳后，分离的蛋白电泳转移到聚二氟乙烯膜上。把膜放置在封闭液(含5%脱脂牛奶和0.05% Tween 20的T-TBS)中孵育1h，室温下膜和HO-1(1∶1000，Sigma)及NQO-1(1∶1000，Sigma)孵育1h，再辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3000，Sigma)室温下和膜孵育1h，洗涤3次，电化学发光(ECL)反应检测信号。

8统计学分析

结 果

1实验动物数量分析

30只SD大鼠全部存活，均纳入结果分析。

2MSCs-CM对IR大鼠肾功能的影响

血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)是评价肾功能的重要指标，其数值的高低反映肾脏损伤程度。根据前期实验结果，发现与空白对照组相比，模型组大鼠在缺血再灌注96h后肾功能恶化明显；而与模型组相比，治疗组BUN、血清肌酐S-Cr明显降低(P<0.01)、尿肌酐U-Cr升高(P<0.01)，这也与前期观察到的大鼠一般情况的改善相对应。见图1。

3组织学分析

在普通光学显微镜下观察每组大鼠肾脏切片，行PAS染色，可见模型组造模后4d肾小管上皮细胞广泛坏死，刷状缘脱落明显，小管呈空泡状；而治疗组光镜下观察到染色图片与空白对照组结果相似，未现明显的肾小管细胞脱落凋亡，刷状缘完好。以特定标准评分得到治疗组评分为2.899±0.023，IR组评分为3.798±0.055，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

a b c

图1 移植MSCs-CM后急性肾损伤大鼠肾功能的变化。a.血尿素氮(BUN)的改变：对照组vs.模型组:**P<0.01；模型组vs.治疗组:**P<0.01；b.血肌酐的改变：对照组vs.模型组:**P<0.01；模型组vs.治疗组，**P<0.01；c.尿肌酐的改变：对照组vs.模型组，*P<0.05；模型组vs.治疗组，**P<0.01

a b

图2 造模后第4天大鼠肾脏组织形态(PAS染色 ×200)。a.空白对照组、模型组及治疗组肾脏组织PAS染色；b.空白对照组、模型组及治疗组病理评分，与空白对照组相比，模型组评分明显增高(P<0.01);与模型组相比，治疗组评分明显降低(P<0.01)

4IR损伤后肾脏组织内活性氧水平。见图3。

5IR损伤后肾实质中抗氧化物质蛋白质表达

HO-1和NQO-1是抗氧化标志物，在IR损伤后96h，治疗组肾脏组织中HO-1和NQO-1的蛋白水平表达明显高于模型组。见图4。

图3 DCFH-DA法检测显示肾脏缺血再灌注损伤各组肾脏组织内活性氧水平(n=5;*P<0.05)。与空白对照组相比，模型组活性氧水平明显增高(P<0.05);与模型组相比，治疗组评分明显降低(P<0.05)

a b c

图4 经尾静脉注射间充质干细胞条件培养基96h后，各组大鼠抗氧化标志物HO-1和NQO-1的蛋白表达水平比较，以GAPDH为内参蛋白，比较目的蛋白条带灰度值与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)条带灰度值的比值。a.建模96h后，空白对照组、模型组及治疗组HO-1、NQO-1的表达水平；b.HO-1表达水平比较：空白对照组vs.模型组，**P<0.01;模型组vs.治疗组:**P<0.01；c. NQO-1表达水平比较：空白对照组vs. 模型组，**P<0.01;模型组vs.治疗组:**P<0.01

讨 论

近年来，多项研究阐明骨髓、脂肪、脐带、胎盘组织等来源的间充质干细胞对肾脏损伤有治疗作用[6-8]，然而其机制尚未明确。Caplan和Dennis[9]提出间充质干细胞通过其内分泌作用机制修复肾脏损伤，同时Du等[10]报道人脐带间充质干细胞也是通过内分泌机制保护和修复缺血再灌注所致的肾脏损伤，提示间充质干细胞内分泌或旁分泌机制的重要性。然而间充质干细胞的移植也存在一定的问题，如体内生存时间、归巢率低、细胞移植的不良反应等。相比之下，条件培养基的获取难度、操作性、安全性及有效性均优于间充质干细胞移植。

本研究通过利用人胎盘来源间充质干细胞条件培养基治疗大鼠缺血再灌注急性肾损伤，观察其对缺血再灌注肾损伤的修复作用及机制，以验证间充质干细胞是通过旁分泌途径对肾缺血再灌注损伤起到保护作用。实验结果显示，大鼠在缺血再灌注96h后，血肌酐、尿素氮明显升高，尿量减少，而通过尾静脉注射人胎盘间充质干细胞来源的条件培养基能显著降低肾脏损伤；同时PAS染色均证实间充质干细胞条件培养基对缺血性急性肾功能衰竭造成的严重的肾小管病变，包括肾小管上皮细胞的大面积死亡均有十分良好的修复作用，表明人胎盘间充质干细胞来源的条件培养基对缺血再灌注肾脏损伤有修复作用。

肾损伤的机制研究发现，氧化应激是诸多肾脏疾病模型的发病机制。本研究应用目前检测活性氧最有效的方法-DCFH-DA法检测缺血再灌注后受损的肾脏组织中活性氧的水平，结果显示模型组肾脏组织内活性氧水平明显升高，而治疗组肾脏组织活性氧水平明显降低，说明人胎盘间充质干细胞来源的条件培养基可以降低缺血再灌注所致的受损肾脏组织的活性氧水平，从而降低氧化应激水平。

为进一步阐明其机制，转录因子NF-E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2-ARE)是研究氧化应激机制中最重要的信号通路之一,HO-1和NQO-1是Nrf2-ARE信号通路中重要的下游靶基因[11]。本研究检测了各组肾脏组织中HO-1及NQO-1的表达水平，HO-1可催化形成胆绿素、胆红素、铁离子。胆绿素和胆红素是体内强有力的自由基清除剂，具有广谱抗氧化能力，而铁蛋白是细胞内抗氧化损伤能力的保护剂[12]；NQO-1借助烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate reduced tetrasodium salt,NADPH)作为电子供体，催化醌类物质发生还原反应，降解醌类及其衍生物，阻止其进一步参与氧化还原反应和ROS活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，发挥抗氧化应激作用[13]。结果显示IR建模96h后，HO-1和NQO-1蛋白的表达在缺血再灌注所致的受损肾脏组织中明显下降，而经过条件培养基治疗后HO-1和NQO-1蛋白表达水平明显增高，其与肾损伤生物学指标和组织学结果一致，提示为应对IR损伤后一系列肾脏损伤过程，MSC-CM通过诱导HO-1和NQO-1蛋白表达增多来增强了大鼠的抗氧化能力及抗损伤能力，与Wu 等[14]所报道的结果一致。

综上所述， 本实验验证了间充质干细胞条件培养基通过抗氧化应激保护可以治疗急性缺血再灌注所致的肾损伤，且间充质干细胞条件培养基可以避免间充质干细胞带来的不良反应，取材容易，给药方便，安全性高；同时也验证间充质干细胞可能是通过旁分泌途径对肾脏缺血再灌注起保护作用，但间充质干细胞条件培养基如何调控HO-1及NQO-1的表达尚未知晓，需待进一步研究探讨。

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Themechanismofmesenchymalstemcellsconditionalmediumderivedfromhumanplacentarepairingtheacutekidneyischemia-reperfusioninjury

WANGJuan1,PANYong-jun2，ZHANGJie3

(1.Emergency Medicine，Huangshi Central Hospital，Edong Healthcare，Huangshi,Hubei 435000,China；2.Intensive Care Unit，Huangshi Traditional Chinese Medicine Hospital，Edong Healthcare，Huangshi,Hubei 435000,China；3.Edong Healthcare Group，Huangshi,Hubei 435000,China)

ObjectiveTo observe the protective effect of tail vein injection of human placenta mesenchymal stem cell conditional medium(MSCs-CM) repairing ischemia reperfusion injury (IRI).MethodsTotally 30 healthy SD male rats were randomly divided into 3 groups，sham group，renal ischemia reperfusion model group(IR group) and MSCs conditional medium injection group(IR+MSCs group) with ten rats in each group. The rodent model of ischemia-reperfusion (IR) injury of kidney was established，MSCs conditional medium were administrated into caudal vein at 24h after IR. The Cr in serum and urine with consecutive 4 days were detected，and then kidney specimens were performed by PAS staining after rats were sacrificed，DCFH-DA was used to detect the content of active oxygen in renal tissue，and the relative expression of HO-1 and NQO-1 were detected by Western Blot.ResultsCompared with IR group，the creatinine from serum and urine in MSCs treated group (IR+MSCs group)were ameliorated apparently after MSCs-CM injection. The pathological histology results demonstrated that the morphological damage of the renal tubule was observed in IR group，and amelioration was observed in MSCs treated group(IR+MSCs group). PAS showed that rats in the sham group had renal tubular injury，which was more severe than that of the MSCs treated group(IR+MSCs group). Western Blot showed notably higher NAPDH quinone oxidoreductase 1(NQO1) and HO-1 protein expression，the two indicators of anti-oxidative capacity，in MSCs treated group(IR+MSCs group) than in sham group.ConclusionMSCs-CM transplanted after caudal vein is helpful for the repair of acute kidney injury induced by ischemia reperfusion injury. The repair mechanism might relate to the anti-oxidative stress.

kidney injury; stem cells; medium; ischemia-reperfusion

1009-4237(2017)12-0924-05

R 692

A

10.3969/j.issn.1009-4237.2017.12.011

435000 湖北，鄂东医疗集团黄石市中心医院急诊医学科(汪娟)； 435000 湖北，鄂东医疗集团黄石市中医院重症医学科(潘勇军)； 435000 湖北 黄石，鄂东医疗集团(张杰)

张杰，E-mail：zhangjie888@sina.com

2017-07-18；

2017-08-01)

秦 楠)