乳制品中单糖、双糖和低聚果糖的同时测定

黄晓林，宋戈，张丽宏，梁杰

（东北农业大学国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨 150028）

乳制品中单糖、双糖和低聚果糖的同时测定

黄晓林，宋戈，张丽宏，梁杰

（东北农业大学国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨 150028）

建立了高效液相色谱同时分离测定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等7种糖的方法。通过调节样品溶液的pH值到1.7和4.5除去样品中蛋白质，采用氨基色谱柱，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，用蒸发光散射检测器检测。7种糖质量浓度在0.01～10.0 mg/mL内具有良好的线性关系，回收率在95.0%～104.1%，精密度(RSD)为1.98%～4.56%，检出限在0.04～0.17 mg/g。该方法可用于乳制品中单糖、双糖和低聚果糖的日常检测。

单糖；双糖；低聚果糖；乳制品；高效液相色谱；蒸发光散射

0 引言

乳糖是奶粉中含量较高的一种糖，可以促进钙离子的吸收和有益菌的成长；低聚果糖具有改善肠道功能，增强免疫功能，促进钙镁铁等矿物元素吸收和抗突变性等多种功效；果糖、葡萄糖、蔗糖也是常用的食品添加剂。糖使用都有相关的限量标准和检测标准[1-4]，目前文献报道糖含量的检测方法主要包括示差折光检测法[5-7]、电化学检测法[8-12]、质谱法[13]和蒸发光散射检测法[14-18]等，但有的灵敏度较低，有的准确度和重复性较差，有的不适用于乳制品检测。

本方法针对乳制品，通过调节样品溶液的pH值除去样品中蛋白质，采用氨基色谱柱分离，用蒸发光散射检测器检测，同测定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，灵敏度高，准确，简单实用。

1 实验

1.1 仪器设备

Waters2695高效液相色谱仪，Alltech2000蒸发光散射检测器,2300TH型超声波振荡仪。

1.2 材料试剂

果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准溶液(1.000 mg/mL)；乙腈(色谱纯)；实验用水均为蒸馏水；亚铁氰化钾水溶液质量浓度为109 g/L；乙酸锌水溶液质量浓度为219 g/L；盐酸溶液浓度为1.0 mol/L，氢氧化钠溶液浓度为1.0 mol/L；以上试剂除标注的外均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Shodex NH2P-50色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：25 ℃；检测器：蒸发光散射检测器；漂移管温度为90℃；气流量为2.2 L/min；流动相A为水；流动相B为乙腈；流速为1.0 mL/min；梯度洗脱程序：0→15 min,10%A线性升至30%A；15→30 min,30%A；30→35 min,30%A匀速降至10%A,保持5 min。

1.3.2 样品处理

乳粉：准确称量3～4 g到三角瓶中，用50℃以下的水25 mL超声溶解；液奶和酸奶：准确称量10～20 g到三角瓶中,加入10 mL水摇匀。然后用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值到1.7后，放置一分钟后再调节样品溶液的pH值到4.5，用水转移到50 mL容量瓶中定容摇匀，滤纸过滤后用0.45 μm滤膜过滤,供分析测定果糖、葡萄糖和低聚果糖，取滤膜过滤滤液稀释10倍供分析测定蔗糖、乳糖。

1.3.3 定量测定

标样、配方乳粉样品和酸奶样品测定的色谱图如图1所示。图1中，峰1～峰7分别为1果糖，2葡萄糖，3蔗糖，4乳糖，5蔗果三糖，6蔗果四糖，7蔗果五糖。

图1 7种目标物混合标准溶液、配方乳粉样品和酸奶样品色谱

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

关于糖类检测，国家检测标准[3-4]推荐的色谱柱是NH2柱，流动相为乙腈与水，比例为70∶30。通过改变乙腈与水的比例发现各种糖的保留时间会发生显著变化，并且随着水的比例的增加而保留时间不断缩短。经过优化通过改变乙腈与水的比例，当以乙腈与水的比例为75∶25等度洗脱时，发现果糖葡萄糖二者保留时间接近，无法完全分离。当乙腈与水比例为以80∶20等度洗脱时，这两种物质分离度有所改善。当乙腈与水比例从80∶20渐变到90∶10，发现二者分离效果较好，但蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖这三种低聚果糖保留时间过长，导致响应小，灵敏度低，而乙腈与水比例为70∶30时，这三种低聚果糖保留时间适当，灵敏度恶较高。通过尝试乙腈与水比例从90∶10渐变到70∶30，果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖被洗脱出来，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖这三种低聚果糖在色谱柱柱前富集，再维持乙腈与水比例70∶30一段时间，加快低聚果糖的洗脱，保证了低聚果糖峰形不拖尾和较高的响应，缩短整体的分离时间。所以在保证各组分良好分离的前提下，加快了乙腈上升的速率，缩短了分析时间，提高了灵敏度，最终的梯度程序为1.3.1节所述。

2.2 检测器参数的确定

载气流速和漂移管温度是蒸发光散射检测器中可以调节的两个重要参数，建立HPLC-ELSD分析方法需要对这两个参数进行优化。由于蔗果五糖灵敏度较低，出峰时间较晚，所以选择蔗果五糖为代表确定蒸发光散射检测器的参数。在相同的载气流速下，漂移管温度从60℃增加，流动相逐渐得到充分挥发，噪声不断降低，而蔗果五糖的响应不断增加，当漂移管温度的温度为90℃时信噪比最高，漂移管温度的温度进一步增加，噪声大小基本维持不变，而蔗果五糖的响应开始大幅度降低，信噪比就降低了如图2（a），所以漂移管温度确定为90℃。在其它条件不变的情况下，载气流速越小，形成的物质粒子半径越大，对激光的散射能力越强，相应的响应信号越大。但并不是载气流速越小越好，因为当载气流速太小时，流动相不能完全挥发，背景噪声会增加，信噪比也会降低。最优载气流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值时的最低流速。在相同的漂移管温度下，载气流速从1.5 L/min增加，流动相逐渐得到充分挥发，噪声不断降低，而蔗果五糖的响应不断增加，当载气流速为2.2 L/min时信噪比达到最高，载气流速进一步增加，噪声略有降低，而蔗果五糖的响应开始大幅度下降，信噪比就变小了如图2（b），所以载气流速确定为2.2 L/min。

2.3 样品提取条件的确定

图2 OPO信噪比与检测器参数的关系

由于乳制品中含有较多的蛋白质和脂肪，如果不除去蛋白和脂肪，不利于提取分离。由于糖易溶于水，用乙腈或乙醇等有机试剂沉淀，加入的量少，沉淀效果不好，加入的量多，会有部分糖析出，都会给出的结果带来影响。加碱或硫酸铜沉淀蛋白，会导致糖类化合物发生化学变化，影响测定结果的准确性。选择国家检测标准[3-4]使用的亚铁氰化钾和乙酸锌作复合沉淀剂，可除去样品中绝大部分蛋白质和脂肪，效果要比加乙腈或乙醇等有机试剂沉淀、加碱或硫酸铜沉淀等其他方法好。但如果亚铁氰化钾和乙酸锌复合沉淀剂加入的少，蛋白沉淀不完全，会给提取和净化带来困难，影响测定，加的过多会造成提取不完全导致被测物的损失，复合沉淀剂的浓度和用量不好控制，此外对色谱柱伤害大，影响色谱柱使用寿命。通过试验，用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值到1.7后，再调节样品溶液的pH值到4.5，沉淀蛋白效果好，糖类不易析出，提取效果好，没有外加入大量的盐有利于蒸发光散射检测器检测，回收率较好，准确度较高。

2.4 标准曲线和检出限

散射光的响应值与粒子质量的关系为I＝kmb，m表示待测组分的粒子质量和，I表示待测组分所产生的散射光光强，k,b为常数。通过使用双对数方法产生线性曲线,即对待测组分的浓度和响应同时取对数,得到线性方程lgI＝blgm＋lgk。分别配制不同浓度的标准混合溶液，在最佳色谱条件下，进行了标准曲线的测定，得到7种糖的回归方程及线性相关系数、线性范围，并以3倍信噪比时的进样浓度计算出了方法的检出限如表1所示。

2.5 回收率

以同一个配方奶粉样品为实验材料，加入一定量的合成色素标准混合溶液,进行加标实验，平行测定3次，以平均测定值计算回收率，结果如表2所示。

2.6 方法的精密度

以同一个配方奶粉样品为实验材料，称取样品后加入5 mg/mL的7种糖标准混合溶液1.0 mL，进行平行8次重复性实验,计算测定值的相对标准偏差(RSD)。这7种糖的RSD在 1.98%～4.56%。由此可以看出，测定结果的较为稳定，方法的重复性较好。

表1 7种糖的标准曲线、相关系数以及线性范围和检出限

表2 7种糖的回收率（n=3）

3 结论

本文重点研究了样品的提取条件、色谱分离条件和检测参数的设定，建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测同时测定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等7种糖的方法。该方法测定结果重现性好，准确度高，简单易操作，适合乳制品中单糖、双糖和低聚果糖的日常检测。

[1]GB 10765-2010食品安全国家标准婴儿配方食品[S].

[2]GB 14880-2012食品安全国家标准食品营养强化剂标准[S].

[3]GB 5009.8-2016食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的测定[S].

[4]GB 5009.225-2016食品安全国家标准食品中果聚糖的测定[S].

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Simultaneous determination of monosaccharides,disaccharides and oligosaccha⁃rides in dairy products

HUANG Xiaolin,SONG Ge,ZHANG Lihong,LIANG Jie
(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150028,China)

A method for simultaneous determination of monosaccharides,disaccharides and oligosaccharides(fructose,glucose,sucrose,lactose,1-kestose,nystose,1F-Fructofuranosyl nystose)in dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was established.Protein in dairy products were mostly eliminated by adjusted pH to 1.7 and 4.5,separated on NH2column with a mixed solution of acetonitrile-water as mobile phase by gradient elution,and detected with an evaporative light-scattering detector(ELSD).All the seven sugars had good linearities with 0.01～10.0 mg/mL.The recovery were 95.0%～104.1%,the relative standard deviations(RSD)were 1.98%～4.56%,the minimum detect⁃able values were 0.04～0.17 mg/g.The method can be used for the routine analysis of these sugars in dairy products.

monosaccharides;disaccharides;oligosaccharides;dairy products;HPLC;ELSD

TS252.7

A

1001-2230（2017）11-0037-03

2017-03-29

黄晓林（1982-），女，工程师，从事乳制品检测与研究。