中西药联合对多重耐药铜绿假单胞菌体外抗菌作用研究
2017-12-19房华汪瑞忠张晓雪杨柳汪海刚
房华++++++汪瑞忠++++++张晓雪++++++杨柳++++++汪海刚
[摘要] 目的 研究中西药联合对多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-PA）抗菌作用，为临床中西药联合治疗MDR-PA感染提供依据。 方法 赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草、小檗碱，煎煮法制备提取液，采用两倍稀释法观察中药对细菌的抑菌效果；采用棋盘格稀释法测定中西药的MIC，通过计算部分联合抑菌指数（FIC）的分布评价中西药联合效果。 结果 五种中药对MDR-PA有不同程度抑菌作用，五倍子对MDR-PA抑菌作用最强；亚胺培南与小檗碱、头孢他啶与五倍子联合有较好的协同相加作用，协同相加率超过80%。环丙沙星与五种中草药联合显示无关作用；三种抗生素与五种中草药联合均无拮抗作用。 结论 赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草、小檗碱对MDR-PA有不同程度抑制作用；亚胺培南与小檗碱、头孢他啶与五倍子联合可以增加各自对MDR-PA抗菌作用的敏感性。
[关键词] 中西药联合；多重耐药铜绿假单胞菌；抗菌活性；协同作用
[中图分类号] R969.4 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）31-0107-04
[Abstract] Objective To study the antimicrobial effect of integrated Chinese and western medicine on multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）， and provide the clinical basis for the integrated Chinese and western medicine treatment of MDR-PA infection. Methods Extract liquid from Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine was prepared by decocting method. The antibacterial effect of traditional Chinese medicine on bacteria was observed by double dilution method. The MIC of Chinese and western medicine was determined by checkerboard dilution method. The effect of integrated Chinese and western medicine was evaluated by calculating the distribution of partial fractional inhibitory concentration （FIC）. Results Five types of traditional Chinese medicine had different degrees of antibacterial effect on MDR-PA， in which the antibacterial effect of Chinese Gall on MDR-PA was the strongest； imipenem had a favorable synergistic effect with berberine， ceftazidime and Chinese Gall， and the synergistic rate combined was over 80%. Ciprofloxacin combined with the five Chinese herbs showed no effect； three types of antibiotics combined with five types of Chinese herbs had no antagonistic effect. Conclusion Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine have different degrees of inhibitory effect on MDR-PA. The combination of imipenem with berberine， ceftazidime and Chinese Gall can increase their susceptibility to antibacterial effect against MDR-PA.
[Key words] Integrated Chinese and western medicine； Multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）； Antimicrobial activity； Synergistic effect
铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌，也是院内感染重要致病菌之一，常引起呼吸道感染、尿路感染、伤口感染、败血症等。随着广谱抗菌药在临床的广泛使用，近年来多重耐药铜绿假单胞菌分离率不断上升，已成为临床感染治疗的难题。我国中医中药治疗疾病已有千年历史，不少中药具有抗菌、抑菌活性、逆转细菌耐药性。为了研究中西药联合对多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa MDR-PA，）抗菌作用，本文選取五种抗菌作用较好的中草药分别与临床常用抗生素进行联合药敏试验，旨在为临床中西药联合治疗MDR-PA感染提供依据，现报道如下。
1 材料与方法endprint
1.1 菌株来源
2015年5月～2016年12月临床分离鉴定的30株MDR-PA（剔除重复分离菌株），30株临床菌株通过法国梅里埃VITEK2-Compact鉴定与药敏检测。标本构成：痰液17株、尿液6株、伤口分泌物4株、血液3株（MDR菌株参照相关文献[1] 的判断标准）。质控菌株：ATCC27853，购自上海市临床检验中心。
1.2 中药水煎剂
赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草（购自养和堂药房），小檗碱（粉剂，中国药品生物检定所），M-H肉汤（购自上海伊华公司）、常用抗生素均由本院药剂科提供。
1.3 方法
1.3.1 中药原液的制备 分别称取上述中药50 g，按5倍量加入蒸馏水浸泡，4℃冰箱内放置24 h后，加热100 ℃ 30 min，过滤，将滤渣再加5倍水加热100 ℃ 30 min。将两次滤液混合加热浓缩至50 mL，生药含量为1 g/mL，调节pH为7.6，离心后留取上清，进行高压灭菌，4℃冰箱保存备用，参考穆廷杰[2]的中药原液制备方法。
1.3.2 菌悬液制备 MDR-PA菌株复苏后，从18～24 h 35℃培养的血琼脂培养基上挑选几个菌落于生理盐水中，调到0.5麦氏浓度（1.5×108 CFU/mL），稀释30倍，向两倍稀释好的药液的1～11支试管加100 μL菌悬液，最终接种量为5×105 CFU/mL。
1.3.3 药液的倍比稀释 中草药抗菌实验采用中草药抗菌实验试管法，参照相关文献[3]进行。药液采用2倍稀释法，即取72支无菌试管，每组12支编号，每管加1 mL肉汤；取上述中药原液，先在第一管加1 mL，混匀后加入第二管中，以此类推，至第10管吸出1 mL弃去，使1～10管含有倍比稀释的药液为1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512，1：1024。
1.3.4 加菌 MDR-PA菌株复苏后，从18～24 h 35℃培养的血琼脂培养基上挑选几个菌落于生理盐水中，调到0.5麦氏浓度（1.5×108 CFU/mL），稀释30倍，向两倍稀释好的药液的1～11支试管加100 μL菌悬液，最终接种量为5×105 CFU/mL，第11管为阳性对照管，第12管不加菌为阴性对照管。
1.3.5 中草药抗菌实验结果判读 35℃孵育18～24 h后观察，阳性对照管长菌需呈浑浊状，而肉汤空白对照管不长菌呈透明清亮状，在此前提下观察实验组的浑浊情况，MIC 是用肉眼在试管中所见能完全抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度。
1.3.6 中西药联合药敏试验 联合药敏试验采用棋盘格微量稀释法检测药物的联合作用，采用9个稀释度，药物最高浓度为其MIC的4倍，依次倍比稀释为1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256倍浓度，两种药物分别在96孔培养板上按纵列和横列进行联合。接种菌量为5×105 CFU/mL，35℃孵育18～24 h后观察结果。
1.3.7 联合抑菌效应判断 根据部分抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）分布判断联合用药效果。FIC的计算：FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+ MIC乙药联合/MIC乙药单用，其中MIC为最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。结果判断：（1）FIC指数≤0.5判定甲乙两药为协同作用；（2）0.5
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，中西药联合与单独使用时MIC数据为呈正态分布的计量资料，采用（x±s）表示，比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 中药单药抗菌作用
五种中药对MDR-PA均有不同程度抑菌作用，抑菌效价为五倍子512～1024，鱼腥草32～64，野菊花8～16，赤芍4～8，小檗碱2～4，抑菌作用强弱顺序为五倍子>鱼腥草>野菊花>赤芍>小檗碱。
2.2 中西药联合用药时FIC指数分布
通过计算FIC值评价联合药敏试验效果，得出30株MDR-PA对不同中西药物组合时FIC指数分布。亚胺培南与小檗碱联合效果最佳，60%菌株呈现协同作用，40%菌株呈现相加作用，头孢他啶与五倍子联合有30%菌株呈现协同作用，50%菌株呈现协同作用，协同相加率超过80%。环丙沙星与五种中草药联合显示无关作用；三种抗生素与五种中草药联合均无拮抗作用。见表1。
2.3 不同中西药组合单独与联合使用情况下MIC值比较
头孢他啶与五倍子组、亚胺培南与小檗碱组单独与联合使用情况下MIC值的比较，中西药联合时用药量低于单独使用时用药量。采用配对t检验，两者存在显著性差异（P<0.05）。见表2。
3 讨论
铜绿假单胞菌是革兰阴性非发酵菌，是一种条件致病菌。随着广谱抗生素碳青霉烯类药物在临床广泛及不合理应用，多重耐药菌不断增加甚至出现泛耐药菌株[4]，MDR-PA存在金属酶、外排泵、膜孔蛋白改变等复杂的耐药机制，单一抗菌药物治疗往往失败，尤其是泛耐药铜绿假单胞菌需要多种药物联合治疗[5，6]。新药的研发速度远跟不上细菌耐药的速度，加之很多抗生素有很大的毒副作用，给临床抗感染治疗带来极大困难[7]。中药抗菌作用有着悠久的历史，近年来的研究已经表明，中药的確有抗菌、延缓、消除细菌耐药性的作用[8-10]。中药的抗菌机制可以分为两类，一类是通过各种途径直接对细菌进行抑制；第二类是通过提高人体的免疫力来抗菌。对中药提高人体免疫力抗菌的这种间接方式研究较少；目前专注于中药药物直接抗菌作用研究较多，也取得了许多成果。许多抗菌抑菌的中药材，一种药材中可能含有多种抑菌抗菌的活性成分，有多种抑菌抗菌的作用靶点，细菌不易对这样的单一中药材产生抗药性突变[11]。某些中药的抑菌成分，可能通过多条抑菌杀菌途径起作用，也具有多种作用靶点，如金建玲等[12]发现小檗碱能与细菌核酸结合而具有抑制细菌DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译等多项功能，能与细菌蛋白质结合并因此干扰多种酶的活性[13]，还能增加细菌细胞膜的通透性[14]。近几年，中药逆转耐药机制作为中药抗菌研究的一个新的邻域悄然兴起，也有了一定的成果，这就给医疗带来巨大的想象空间，中药联合可否改变即将面临无药可用的尴尬局面？为了发挥中西药在抗菌治疗方面的各自优势，本课题从中西药联合使用角度来探索治疗多重耐药铜绿假单胞菌方法。
从本研究结果上看，五种中药提取物对多重耐药铜绿假单胞菌具有一定抗菌作用，与相关文献[15]报道一致，五倍子抗菌效果最好，抑菌效价达到215～1024，抑菌作用由强至弱为：五倍子>鱼腥草>野菊花>赤芍>小檗碱。对30株MDR-PA的中西药联合药敏试验，亚胺培南与小檗碱联合效果最佳，协同相加率为100%，亚胺培南的药物浓度平均降低至原来2/3，小檗碱的药物浓度从275 mg/mL降至20.80 mg/mL（P<0.01）；头孢他啶与五倍子联合协同相加率为80%，头孢他啶与五倍子药物浓度平均降低至原来浓度1/2（P<0.05）；环丙沙星与五种中草药联合显示无关作用；三种抗生素与五种中草药联合均无拮抗作用。中草药蒸煮提取物成分复杂，使用剂量也比较大[16]，恰当的中西药联合将大幅提高中药与西药的抗菌抑菌能力。随着科学技术的进步，中药活性成分的提取物也得到迅速发展。提高中草药活性成分的抗菌效价，必将使中药在抗菌治疗方面得到长足发展。发挥中西药联合使用在对抗细菌抗药性方面的优势是目前抗菌治疗的新的方向，中西药配伍对临床常见菌株有良好的体外抗菌作用[17]。中药的水煎液与含药血清与抗生素联合使用均有较好的效果，石庆新等[18]发现中药联用可以大大提高亚胺培南对耐药菌的抑菌和杀菌作用，这与本研究结果基本一致。中药的成分复杂，在体内可能通过各种代谢途径发挥其抗菌作用，如促进细胞的抗原递呈作用，增强吞噬细胞对细菌的吞噬能力；或发挥中药的免疫调理作用，影响机体的健康状态，进而对机体微生态造成影响。虽然本文利用中西药对细菌的体外联合药敏试验，反映中西药对细菌的直接抗菌作用，但也可说明中药的某些成分与西药有协同抗菌作用。临床实践中，中西药联合治疗疾病的例子有许多，如肠炎[19]、胃炎[20]、肾盂肾炎[21]、盆腔炎[22]等的治疗。这也间接证明本研究中西药联合治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染的可行性。
总之，中药研究已经成为人们关注的热点，中药的现代化也已列入国家中长期发展规划。中西药联合使用成为缓解和控制细菌耐药性难题的一条可行途径。中西药联合在治疗多重耐药菌或泛耐药菌感染方面也应该得到发展，这方面的研究应该得到关注。
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（收稿日期：2017-08-12）endprint
