非小细胞肺癌患者血清中miRNA-449a的表达及其临床意义

张笑添，刘利红(山西医科大学汾阳学院生物化学教研室,汾阳 0300;山西省汾阳医院呼吸内科;通讯作者,E-mail:604864@qq.com)

非小细胞肺癌患者血清中miRNA-449a的表达及其临床意义

张笑添1*，刘利红2
(1山西医科大学汾阳学院生物化学教研室,汾阳 032200;2山西省汾阳医院呼吸内科;*通讯作者,E-mail:116048164@qq.com)

目的 探讨miRNA-449a在非小细胞肺癌患者血清中的表达及其临床应用价值。 方法 采用荧光定量PCR法检测26例非小细胞肺癌患者和30例健康人群血清中miRNA-449a的表达含量,分析血清miRNA-449a的含量与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系,并通过受试者工作曲线(ROC)分析miRNA-449a在非小细胞肺癌诊断中的特异性和敏感性。 结果 非小细胞肺癌患者血清中miRNA-449a的含量显著低于健康人群(P<0.05);非小细胞肺癌血清中miRNA-449a的表达与肿瘤TNM分期以及淋巴结转移有相关性(P<0.05),与病理组织学类型无相关性(P>0.05)。ROC曲线下面积(AUC)为0.840(95%CI 0.693-0.986),取0.624作为其临界值时,其敏感性和特异性分别为77.8%和84.6%。 结论 miRNA-449a在非小细胞肺癌血清中低表达,并可能成为非小细胞肺癌患者诊断的肿瘤标志物之一。

非小细胞肺癌; miRNA-449a; ROC曲线

肺癌作为全球发病率较高的恶性肿瘤之一,其死亡率居于榜首[1]。绝大多数肺癌患者在就诊时已经属于中晚期,其最低的生存期仅有15%[2],因此肺癌的早期诊断就显得尤为重要。miRNA作为一种非编码RNA,可以通过结合靶基因的3′UTR区以转录后调控的方式调节基因的表达,进而发挥着多种生物学功能。近几年研究表明,miRNA的表达与肿瘤的发生发展密切相关,同时在血清中可以长期稳定存在,因此有可能作为一种早期的肿瘤标志物应用于临床[3]。已有研究发现miRNA-449a在非小细胞肺癌患者组织中的表达明显降低[4,5],但是miRNA-449a在非小细胞肺癌患者血清中表达的相关研究则尚未报道。因此在本研究中,通过荧光定量PCR检测miRNA-449a在非小细胞肺癌患者血清中的表达,探讨miRNA-449a在非小细胞肺癌中的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

血清标本来自于2016-08～2017-04山西省汾阳医院呼吸内科收治的非小细胞肺癌患者26例,其中男14例,女12例,年龄范围为45-78岁,病理类型包括腺癌10例,鳞癌16例,TNM分期则根据国际肺癌研究会(IASLC)公布的分期原则,其中Ⅰ-Ⅱ期9例,Ⅲ-Ⅳ期17例,所有患者经过病理活检确诊且未进行抗肿瘤治疗。同时选取体检中心的健康人群30例,其中男14例,女16例作为对照组,年龄范围为40-69岁,经检查无肝、脑等脏器疾病,无消化道以及血液病史。本研究经过本院伦理委员会批准,均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

miRcute血清miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量PCR试剂盒、miRNA-449a引物以及外参均购于北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.4 荧光定量PCR检测血清中miRNA-449a的表达 荧光定量PCR的反应体系为20 μl,其中2×miRNA Plus miRNA Premix 10 μl,上下游引物各0.5 μl,cDNA产物2 μl,其余用水补齐。反应条件为:95 ℃预变性15 min;94 ℃ 20 s,60 ℃ 34 s,40个循环,后续进行熔解曲线分析,所有样本均做3个复孔,miRNA-449a的相对表达量采用2-ΔΔCt表示。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 miRNA-449a的表达水平

荧光定量PCR结果显示非小细胞肺癌患者血清中的miRNA-449a的表达量为0.82±0.55,显著低于健康对照组的2.08±1.20,差异具有统计学意义(P<0.05,见图1)。

与健康对照组相比,*P<0.05图1 非小细胞肺癌和健康对照组血清中miRNA-449a的表达水平Figure 1 The expression of miRNA-449a in non-small cell lung cancer and healthy controls

2.2 非小细胞肺癌患者血清miRNA-449a的含量与临床病理参数之间的关系

非小细胞肺癌患者血清中的miRNA-449a表达在TNM分期Ⅲ-Ⅳ的水平显著低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ(P<0.05),淋巴结有转移患者其表达显著低于无转移患者(P<0.05),但miRNA-449a的水平与不同性别、不同年龄以及不同组织学类型等临床病理参数之间差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

2.3 ROC曲线分析诊断效率

通过检测非小细胞肺癌患者和健康对照组血清中miRNA-449a的水平建立ROC曲线,miRNA-449a ROC曲线下面积(AUC)为0.840(95%CI 0.693-0.986),miRNA-449a取0.624为其临界值时,其敏感性和特异性分别为77.8%和84.6%(见图2)。

3 讨论

近几年来,miRNA已经逐渐成为了研究的热点,外周血循环中的miRNA由于具备有一定的组织特异性以及稳定性[6],更多的作为肿瘤标志物之一[7],用来监测肿瘤的发生和发展。miRNA-449a在胃癌[8]、膀胱癌[9]等的表达下调,有研究报道,miRNA-449a在肺癌[4,5,10]中的表达也是下调的,同时研究发现miRNA-449a可以靶向调控c-Met[4]、E2F3[11]、E2F1[12]等基因进而调控肺癌细胞增殖和迁移,这些研究提示miRNA-449a参与了非小细胞肺癌的形成与发展,可能是一个潜在的诊断分子标志物。也有研究[13]发现，非小细胞肺癌患者血清中的miRNA-449a的水平下降,但是miRNA-449a在非小细胞肺癌中的诊断价值则尚未报道。

临床病理参数nmiRNA⁃449a的表达量tP性别0 013>0 05 男141 537±0 24 女121 538±0 22年龄0 522>0 05 ≤60岁61 82±0 69 >60岁201 66±0 58吸烟史0 776>0 05 无111 62±0 52 有151 81±0 61组织学类型0 081>0 05 鳞癌161 76±0 42 腺癌101 74±0 48TNM分期4 574<0 05 Ⅰ-Ⅱ91 53±0 23 Ⅲ-Ⅳ170 95±0 35淋巴结转移6 144<0 05 有110 93±0 31 无151 71±0 32

图2 非小细胞肺癌患者血清miRNA-449a的ROC曲线Figure 2 The ROC curve of serum miRNA-449a in non-small cell lung cancer

本研究中,通过荧光定量PCR检测非小细胞肺癌患者血清中miRNA-449a的表达,结果发现miRNA-449a在非小细胞肺癌患者的水平显著低于健康对照组,同时进一步分析miRNA-449a与临床病理参数之间的关系,发现TNMⅢ-Ⅳ期的患者miRNA-449a的水平低于TNMⅠ-Ⅱ期的,淋巴结转移的患者miRNA-449a的水平也低于淋巴结未转移的,此结果说明miRNA-449a在非小细胞肺癌的发生和发展中可能起到了抑癌基因的作用,其水平与淋巴转移以及TNM分期密切相关。而ROC曲线结果显示其曲线下面积(AUC)为0.840,敏感性和特异性分别为77.8%和84.6%,此结果提示miRNA-449a有可能作为一种新型分子标志物用于小细胞肺癌的诊断。

综上所述,miRNA-449a在非小细胞肺癌血清中表达显著降低,并有可能作为一种肿瘤标志物之一,但是由于研究的样本数量较少,其临床价值还有待于扩大样本数量进一步验证。

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ExpressionofmiRNA-449ainserumanditsclinicalsignificanceinpatientswithnon-smallcelllungcancer

ZHANG Xiaotian1*,LIU Lihong2
(1DepartmentofMedicalLaboratoryScience,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China;2FenyangHospitalofShanxiProvince;*Correspondingauthor,E-mail:116048164@qq.com)

ObjectiveTo investigate the expression of miRNA-449a in serum of patients with non-small cell lung cancer and its clinical significance.MethodsThe quantitative real-time PCR was used to detect the expression of miRNA-449a in 26 non-small cell lung cancer patients and 30 healthy controls. The relationship between the serum of serum miRNA-449a and clinical pathological parameters was analyzed. The specificity and sensitivity of miRNA-449a in the diagnosis of non-small cell lung cancer was determined by receiver-operating characteristic(ROC) curves.ResultsThe expression of miRNA-449a in non-small cell lung cancer was significantly lower than that of healthy controls(P<0.05). The expression of miRNA-449a was significantly associated with the tumor clinical stage(TNM) and lymphatic metastasis(P<0.05), and the expression of miRNA-449a was not significantly associated with the histological type(P>0.05).The area under ROC was 0.840(95%CI 0.693-0.986), and the sensitivity and specificity were 77.8% and 84.6% when 0.513 was selected as the critical value.ConclusionThe expression of serum miRNA-449a is significantly reduced in patients with non-small cell lung cancer cell, and it may be a biomarker for the clinical diagnosis of non-small cell lung cancer.

non-small cell lung cancer; miRNA-449a; ROC curve

山西医科大学汾阳学院科研项目(2017B05)

张笑添,女,1982-05生,硕士,讲师,E-mail:116048164@qq.com

2017-09-11

R734.2

A

1007-6611(2017)12-1273-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.015