掺镁透钙磷石对骨质疏松兔骨缺损的成骨效果

贾婉萍,梁立硕,冯凯悦,周秋娟,梁永强(华北理工大学口腔医学院正畸科,唐山 063000;通讯作者,E-mail:lych810@foxmail.com)

掺镁透钙磷石对骨质疏松兔骨缺损的成骨效果

贾婉萍,梁立硕,冯凯悦,周秋娟,梁永强*
(华北理工大学口腔医学院正畸科,唐山 063000;*通讯作者,E-mail:lych810@foxmail.com)

目的 探讨掺镁6.67%透钙磷石骨水泥修复家兔骨质疏松的桡骨骨缺损的成骨效果。 方法 27只雌性新西兰白兔进行骨质疏松造模,之后随机分为对照组、透钙磷石组、掺镁6.67%透钙磷石组(掺镁6.67%组),每组9只。在双侧桡骨中段制作长15 mm的骨缺损,缺损处对照组不充填任何材料,透钙磷石组植入透钙磷石骨水泥,掺镁6.67%组植入掺镁6.67%透钙磷石骨水泥。于术后4,8,12周,通过肉眼观察、拍摄X线片观察缺损区影像学变化和免疫组化观察血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)在缺损区的表达与分布判断骨缺损的修复情况。 结果 12周时掺镁6.67%组骨缺损修复基本完成,其余组缺损仍成凹形,掺镁6.67%组成骨效果最佳;免疫组化显示,PDGF在第4周表达最高,8周、12周时逐步降低,4周、8周时,掺镁6.67%组表达比透钙磷石组高,差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论 掺镁6.67%透钙磷石可促进骨质疏松骨缺损的愈合,修复早期可促进PDGF的表达。

桡骨骨缺损; 骨质疏松; 掺镁透钙磷石; 血小板源性生长因子; 兔

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性骨代谢性疾病,具有骨量降低、骨微结构破坏、骨质脆性增加的特点,老年人和绝经后女性比较多发,易发生骨折且愈合缓慢。随着中国进入老龄化社会,患有骨质疏松症的患者越来越多。外伤、畸形、肿瘤等诸多因素都会造成骨组织损伤,近年来骨组织工程学飞快发展,骨替代生物材料研究成为热点。透钙磷石与动物硬组织中矿物质成分相似,可作为支架材料植入骨缺损,自身降解的同时能引导周围骨组织的生长。骨骼中锶(Sr)、镁(Mg)等微量元素参与骨的新陈代谢。目前关于掺锶透钙磷石的研究多有报道[1,2],国内尚无透钙磷石中掺入Mg离子的研究,国内外尚无掺镁透钙磷石修复骨质疏松骨缺损的研究。镁(magneium,Mg)是人体内重要的元素,参与细胞的增殖分化,影响骨基质和骨矿物质的代谢,在骨生长中起着重要作用。透钙磷石分子结构中的钙元素比较活泼,容易被别的元素取代,本实验将镁离子引入透钙磷石中修复骨质疏松家兔桡骨骨缺损,以期能促进骨质疏松骨缺损的愈合,缩短修复时间。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

磷酸氢钙二水合物(CaHPO4·2H2O),碳酸钙(CaCO3),三水合磷酸氢镁(MgHPO4·3H2O,Sigma-Aldrich,Spain),一水磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2·H2O),焦磷酸钠(Na4P2O7),一水柠檬酸,以上材料均购于天津光复精细化工有限公司,分析纯。

1.2 骨水泥的制备

将CaHPO4·2H2O和CaCO3以2 ∶1的摩尔比均匀混合后置于马沸炉,1 000 ℃下烧结12 h制备β-TCP[3]。用摩尔比2 ∶1的(MgHPO4·3H2O+CaHPO4·2H2O)和CaCO3烧结制备β-TCMP。Mg/(Mg+Ca)的摩尔分数为6.67%,(Mg+Ca)/P摩尔比恒定为1.5。烧结后充分研磨,β-TCP和β-TCMP粉末分别与Ca(H2PO4)2·H2O、焦磷酸钠、和3 g/ml固化液调拌30 s,装入高10 mm,直径5 mm的圆柱形模具中,37 ℃恒温箱固化24 h后脱模。

1.3 建立骨质疏松模型

采用肌注地塞米松+去势的方法建立兔骨质疏松模型[4,5]。麻醉,取仰卧位,备皮消毒,铺无菌洞巾。沿腹白线切开2 cm打开腹腔,将卵巢两端的血管和组织结扎,切除双侧卵巢后缝合。术后肌注地塞米松0.5 mg/kg,每周2次,持续8周。

术后8周进行腰椎的骨密度(bone mineral density,BMD)检测。结果显示术后BMD均值小于术前均值减去2倍标准差[6],提示造模成功。

1.4 实验动物与分组

4月龄雌性新西兰大耳白兔27只,2.0-2.5 kg,同一种源,清洁级。由华北理工大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(京)2007-0001。骨质疏松造模后随机分为对照组、透钙磷石组和掺镁6.67%组,每组9只。本实验操作均遵循实验动物伦理委员和管理委员会规定。

1.5 骨缺损的制备及骨水泥的植入

10%水合氯醛3 ml/kg经耳缘静脉注射麻醉,取仰卧位,备皮消毒,铺无菌洞巾。前臂桡侧处作切口,分离筋膜,暴露桡骨。用无菌不锈钢尺测量15 mm,用手术刀切开两截骨点骨膜,齿科低速涡轮机和砂轮垂直截取15 mm桡骨,同时用无菌生理盐水冲洗降温[7]。缺损处置入消毒好的水泥块后缝合。术后连续肌注青霉素3 d,每次20万单位,每日两次。

1.6 观察指标

术后观察家兔状态、进食进水情况,及有无感染。于4,8,12周处死动物每组各3只,肉眼观察后将其固定于4%多聚甲醛溶液中48 h,骨缺损处拍摄X线片观察缺损区修复的影像学变化。免疫组化观察PDGF的表达情况,用Image-Pro Plus6.0软件测量BMP-2的平均光密度值(MOD值)。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 大体观察

骨水泥周围软组织均未出现变性坏死,无化脓感染。4周时,对照组大量纤维组织充填缺损区,未见骨痂;透钙磷石组骨水泥边缘溶解,骨水泥溶解部分被纤维性骨痂代替;掺镁6.67%组骨水泥大部分溶解,骨痂生成较多。8周时,对照组可见少量新生骨;透钙磷石组缺损呈凹形;掺镁6.67%组有大量新生骨但连接不全。12周时,对照组缺损面积较大;透钙磷石组缺损端新骨呈浅凹形相接;掺镁6.67%组缺损区基本修复(见图1)。

2.2 X线表现

4周时,对照组低密度透射影像,边缘规则;透钙磷石组骨水泥边缘少量溶解;掺镁6.67%组有新生骨沉积,骨水泥大部分溶解。8周时,对照组未见新骨影像;透钙磷石组缺损断端和底部的骨沉积形成楔形;掺镁6.67%组骨水泥大部分溶解,新生骨呈楔形沉积在骨缺损两端段,尚有部分缺损未修复。12周时,对照组骨缺损仍有大面积未修复,断端硬化,未出现骨性联接;透钙磷石组缺损未完全修复;掺镁6.67%组缺损完成修复,但骨髓腔未见明显再通影像(见图2)。

图1 各组骨缺损大体观察Figure 1 Gross observation of bone defects in each group

图2 各组骨缺损X线观察Figure 2 X-ray of bone defects in each group

2.3 免疫组化结果

PDGF是与创伤修复过程相关的因子,本实验主要表达在骨痂中的破骨细胞、成骨细胞、骨髓中未分化的间充质细胞的胞质内。细胞质内呈现棕黄色颗粒即为阳性表达,深棕为强阳性,浅黄为弱阳性。4周时,三组PDGF均为强阳性表达,其中对照组表达最少,掺镁6.67%组最多。8周、12周时,PDGF阳性表达逐步减少,组间区别同第4周(见图3)。

2.4 各组PDGF表达的平均光密度值比较

用Image-Pro Plus 6.0测得每组PDGF表达的MOD值,比较各组之间的差异。单因素方法分析结果显示,同组不同时间PDGF表达差异有统计学意义(P<0.05)。4周和8周时,三组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

组别 4周8周12周FP 对照组0 1470±0 01290 1266±0 01450 1244±0 01474．710<0．05 透钙磷石组0 1745±0 0140∗0 1478±0 0160∗0 1304±0 020510．168<0．05 掺镁6 67%组0 2020±0 0182∗#0 1781±0 0150∗#0 1421±0 013721．931<0．05

与对照组比较,*P<0.05;与透钙磷石组比较,#P<0.05

3 讨论

研究表明[8]，骨质疏松发生的主要原因是由于人体大量增加的哈弗氏重构,家兔具有完整的哈弗氏重构系统,可以模拟该病理过程。兔前肢承重小,桡骨和颌骨具备相似的骨环境,且骨缺损实验易于制备和得到满意的实验结果,因此许多颌面外科研究用桡骨进行实验。实验通过去势降低雌激素使骨代谢异常和注射地塞米松在基因和分子水平降低骨细胞的活性,制造骨质疏松动物模型。缺损为切除桡骨中段15 mm,对照组12周时未愈合,符合极限缺损要求。

骨质疏松症患者由于骨再生能力缺乏,骨修复常常发生延迟愈合和愈合障碍等症状。中国慢慢进入人口老龄化社会,患骨质疏松症的人群也日益增长,骨质疏松骨的愈合治疗逐渐成为研究热点。镁元素参与骨生长和骨代谢,对于预防和治疗骨质疏松症有重要的意义。Mutlu等[9]研究表明,正常血清中镁的浓度显著高于骨质疏松症患者,骨质疏松症的发生可能与镁的缺乏有关。Aydin等[10]每日给绝经后患骨质疏松症的妇女补充柠檬酸镁1 830 mg,1个月后骨钙素水平显著升高,提示补充适量的镁对治疗骨质疏松症有一定的作用。本实验将镁离子引入透钙磷石中,Mg/Mg+Ca摩尔百分数为6.67%,含镁量约为2%。镁离子置换钙离子后,透钙磷石的孔隙率增加,为成骨细胞的黏附增殖提供空间,利于新骨的长入。Cabrejosazama等[11]细胞实验显示掺镁透钙磷石具有较好的生物相容性。12周时,掺镁6.67%透钙磷石组基本修复完成,而对照组仍有大面积骨缺损,透钙磷石组缺损呈浅凹形,未完全修复。镁的加入缩短了骨缺损的修复时间,增强了骨修复的成骨效果。镁的加入增加了骨水泥的吸收速度,同时加快了新骨的形成,降解时间与骨修复平衡比透钙磷石有所改善。

PDGF是一类具有有丝分裂和趋化作用的多功能阳离子糖蛋白,主要由血小板产生。能够促进成骨和软骨细胞增殖,从而刺激骨修复和发挥成骨作用,在骨愈合中起重要的作用[12]。当血清中其浓度较低时,骨缺损可能会延期愈合[13]。Chang等[14]通过大鼠牙槽骨缺损研究发现,在骨修复过程中都有PDGF的参与,早期作用较大。在各组PDGF均在4周时表达最高,未分化间充质细胞、成纤维细胞和成骨增殖活跃,大量充填在缺损区。8周、12周时表达逐步下降,新骨趋于成熟,细胞活动减少。提示PDGF主要作用于骨缺损修复早期。不同时间段,掺镁6.67%组PDGF表达最高,对照组最低,表明镁的加入促进了PDGF的形成,刺激了成骨细胞的活性与增殖,促进了骨的沉积钙化,从而加快了形成新骨和骨缺损修复的速度。

掺镁6.67%透钙磷石骨水泥具有良好的生物相容性和明显的成骨效果,镁的掺入促进了PDGF的表达,缩短了骨缺损修复时间。作为骨替代材料,对临床骨修复方面的应用提供参考和理论依据。

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Effectofmagnesium-dopedcalciumhydrogenphosphatedehydrateonosteogenesisinosteoporoticbonedefectrabbits

JIA Wanping,LIANG Lishuo,FENG Kaiyue,ZHOU Qiujuan,LIANG Yongqiang*
(DepartmentofOrthodontics,CollegeofStomatology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China;*Correspondingauthor,E-mail:lych810@foxmail.com)

ObjectiveTo evaluate the effect of 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate on the repair of osteoporotic radius bone defect in rabbits.MethodsTwenty-seven female New Zealand rabbits were used to establish osteoporotic bone defect model, and then randomly divided into 3 groups(n=9 in each group): control group, calcium hydrogenphosphate dehydrate group and 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate group(6.67% magnesium-doped group).All rabbits were defected 15 mm long in bilateral radius. The defect was not filled in blank group,while the defect was filled with 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate and calcium hydrogenphosphate dehydrate in the other two groups,respectively. The repair of bone defect was observed by naked eyes, the image changes of bone defect was observed by X-ray, and the expression and distribution of platelet-derived growth factor(PDGF) were observed by immunohistochemistry at 4,8,12 week after operation.ResultsThe repair of bone defect was basically completed at 12 week in 6.67% magnesium-doped group, but remained concave in the other two groups. The effect in 6.67% magnesium-doped group was the best among three groups. The immunohistochemistry showed that the expression of PDGF was the highest at 4 week, and then decreased gradually. The expression of PDGF in 6.67% magnesium-doped group was higher than that of calcium hydrogenphosphate dehydrate group at 4, 8 week(P<0.05).ConclusionThe 6.67% magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate can not only promote the healing of bone defect in osteoporosis but also promote the expression of PDGF in the early stage of repair.

radial bone defect; osteoporosis; magnesium-doped calcium hydrogenphosphate dehydrate; platelet-derived growth factor; rabbits

国家自然科学基金资助项目(81270965);河北省教育厅重点项目(ZD2015016)

贾婉萍,女,1989-10生,硕士,住院医师，E-mail:1198728614@qq.com

2017-08-26

R783

A

1007-6611(2017)12-1260-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.013