乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3、Th17细胞、CD4+Treg细胞的变化及意义

王 玲,蔚梅芳,武希润(山西省荣军医院内科,太原 000;洛阳市中心医院消化科;山西医科大学第二医院消化科;通讯作者,E-mail:xirunwu66@6.com)

乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3、Th17细胞、CD4+Treg细胞的变化及意义

王 玲1,蔚梅芳2,武希润3*
(1山西省荣军医院内科,太原 030031;2洛阳市中心医院消化科;3山西医科大学第二医院消化科;*通讯作者,E-mail:xirunwu66@163.com)

目的 检测乙肝肝硬化患者外周血中25-(OH)D3、Th17、CD4+Treg细胞变化,为维生素D治疗乙肝肝硬化提供依据。 方法 选取乙肝肝硬化患者21例,正常对照者15例,采用电化学发光免疫测定法检测25-(OH)D3水平,采用流式细胞仪检测Th17细胞、CD4+Treg细胞水平,并计算Th17/Treg比率。 结果 健康对照组外周血25-(OH)D3为(31.87±5.97)ng/ml,乙肝肝硬化组25-(OH)D3明显降低,为(11.89±6.04)ng/ml,两者相比差异具有统计学意义(t=9.510,P=0.001)。与健康对照组相比,乙肝肝硬化组外周血Th17细胞百分比(0.913%±0.216%vs2.498%±2.583%)增高,CD4+Treg细胞百分比降低(3.964%±1.116%vs2.333%±1.714%),Th17/Treg比率(1.199±0.973vs0.256±0.138)增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论 乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3水平显著降低,Th17增高,CD4+Treg降低,存在CD4+Treg、Th17、Treg/Th17免疫平衡紊乱,增加外周血25-(OH)D3水平有可能调节乙肝肝硬化患者体内CD4+Treg、Th17、Treg/Th17变化,改变其免疫状态。

乙肝肝硬化; 25-羟维生素D3; CD4+Treg细胞; Th17细胞

肝硬化是慢性肝病进行性发展的结果,在我国以乙肝肝硬化最多见,占肝硬化病因66%。正常情况下,CD4+T细胞亚群,CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)和辅助T细胞17(T helper type 17 cell,Th17)在维持机体免疫平衡方面发挥重要作用,Thl7/Treg和Thl/Th2处于相对稳定的免疫平衡状态中。Thl/Th2免疫平衡失调导致HBV不能被宿主完全清除是病情迁延不愈、出现慢性肝损伤的主要原因,Th17/Treg的免疫平衡失调与HBV相关急慢性肝衰竭的免疫损伤和HBV再感染有关[1]。维生素D(VitD)是重要的双向免疫调节剂,具有免疫调节、抗炎及抗纤维化等作用。25-(OH)D3能够调节CD4+、CD8+细胞数量及比例,上调Th2细胞和Treg细胞的活性,抑制Th1和Th17细胞的活性,促进CD4+T细胞分化时偏向Th2[2]。然而,VitD、Th17、CD4+Treg细胞在乙肝肝硬化发病中的作用及其相互关系研究少有报道。本研究着重检测乙肝肝硬化患者的外周血25-(OH)D3、Th17、Treg细胞水平变化,旨在为25-(OH)D3临床应用于乙肝肝硬化治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

病例选择2015-04～2015-09在山西医科大学第二医院明确诊断为乙肝肝硬化病人(肝硬化组)21例,其中男13例,女8例,年龄29-74岁,中位年龄59岁。健康对照组15例来自2015-06～2015-12山西医科大学第二医院体检中心,其中男7例,女8例,年龄39-72岁,中位年龄58岁。

1.2 方法

抽取空腹静脉血6-8 ml,加入肝素抗凝,取3-3.5 ml人外周血淋巴细胞分离液加入10 ml的灭菌离心管中,分离外周血单个核细胞(PBMC),调整细胞数为1×106/ml。淋巴细胞表面染色、洗涤、破膜、胞内染色,进行Treg细胞、Th17细胞标记,流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用LSD-t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3变化

乙肝肝硬化患者外周血25-(OH)D3水平较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

组别n25⁃(OH)D3tp健康对照组1531 87±5 979 5100 001肝硬化组 2111 89±6 04

2.2 乙肝肝硬化患者外周血Th17细胞、CD4+Treg细胞、Th17/Treg细胞变化

乙肝肝硬化患者外周血Th17细胞增多,CD4+Treg细胞减少,Thl7/Treg细胞比值增高,表现为Thl7/Treg细胞失衡,与健康对照组相比差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

组别nTh17(%)Treg(%)Th17/Treg 健康对照组150 913±0 2163 964±1 1160 256±1 138 肝硬化组 212 498±2 5832 333±1 7141 199±0 973 t-2 5203 141-3 950 P<0 05<0 05<0 05

3 讨论

肝硬化患者体内也存在免疫功能紊乱,有研究表明,Th17细胞的数量与肝损伤标记水平密切相关[3]。具有强大促炎效应的Th17细胞通过IL-17/IL-17R信号途径直接激活肝星状细胞,而激活的肝星状细胞分泌大量促炎性细胞因子加剧肝脏炎症反应,加速肝硬化的进程。Treg细胞通过分泌细胞因子TGF-β或细胞间直接接触作用于肝星状细胞[4,5],抑制特异性T细胞的免疫反应,维持免疫耐受。国内外许多研究[6-9]表明,慢性乙型肝炎患者外周血中Th17细胞、Treg细胞水平均明显升高,在HBV感染过程中,Treg细胞及其高表达的转录因子FoxP3共同抑制HBcAg诱导的Th17细胞亚群的增殖、分化,造成Th17/Treg比例的失衡[10],Th17/Treg免疫平衡被打破会进一步加快肝硬化的进程,进而加大罹患肝癌的风险[11]。

保持Th17/Treg的免疫平衡可以有效维持免疫应答的正常状态,但Th17/Treg免疫平衡状态与乙肝肝硬化发生发展的关系尚不清楚。在4周、8周和12周四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型体内,Th17细胞数增加,但Treg细胞数逐渐减少[12]。Yu等[13]发现,在乙肝肝硬化尤其是失代偿期患者体内,IL-10、IL-23、IL-17、TGF-β都明显升高,TGF-β/IL-17、Th17/Treg比率升高,提示Th17/Treg免疫平衡失调可能通过HSC激活促进肝纤维化及肝硬化进程。本研究中,乙肝肝硬化组外周血Th17细胞水平高,Treg细胞水平低,Th17/Treg比率高,提示乙肝肝硬化存在Th17、Treg、Th17/Treg免疫紊乱,免疫抑制效应减弱而免疫炎性效应增强诱导了外周血T细胞亚群的紊乱以及外周免疫耐受的破坏,有可能促进肝硬化的发生、发展。

近年来研究表明,在慢性肝病,尤其是肝硬化患者,存在VitD缺乏[14]。本研究通过检测乙肝肝硬化患者体内的25-(OH)D3水平发现,其25-(OH)D3水平较对照组明显降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。

越来越多的研究表明,VitD是免疫调节剂,与免疫调节有关。25-(OH)D3缺乏与丙肝肝硬化严重的肝细胞坏死及肝纤维化密切相关[15]。Gal-Tanamy等[16]研究表明VitD通过诱导IFN-γ和MxA基因表达抑制人类肝细胞丙型肝炎病毒(HCV)复制,并增强VitD受体表达,产生协同抗病毒治疗作用,最终可能延缓或阻止丙肝肝硬化进展。Treg细胞有效抑制了过强的免疫反应,及时阻止肝细胞的持续损伤,但同时也阻止了机体清除HBV的能力,使乙型肝炎感染慢性化。1,25-(OH)2D3被转运到靶组织中结合VitD受体后进行信号转导,直接或间接作用于淋巴细胞,抑制T淋巴细胞的增殖、分化,抑制Th17细胞分泌促炎细胞因子IL-17[16]。VitD对T细胞也有一定的刺激作用,T细胞受刺激后可以表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和FoxP3,从而诱导Treg细胞产生[17]。本实验结果表明,肝硬化患者25-(OH)D3明显降低,Th17细胞增加,Treg细胞降低、Th17/Treg增加,推测25-(OH)D3缺乏打破了Th17/Treg免疫平衡,参与乙肝肝硬化发生、发展。

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Alterationsof25-hydroxyvitaminD3,Th17cellsandCD4+TregulatorycellsinperipheralbloodinpatientswithhepatitisBcirrhosis

WANG Ling1,YU Meifang2,WU Xirun3*
(1DepartmentofInternalMedicine,ShanxiRongjunHospital,Taiyuan030031,China;2LuoyangCentreHospital,HenanProvince;3DepartmentofGastroenterology,SecondHospitalofShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:xirunwu66@163.com)

ObjectiveTo explore the alterations of 25-hydroxyvitamin D3,Th17 cells and CD4+T regulatory cells in peripheral blood of patients with hepatitis B cirrhosis.MethodsTwenty-one patients with hepatitis B cirrhosis and 15 healthy volunteers were enrolled in the study. Electrochemical luminescence immunoassay was used to detect the level of 25-hydroxyvitamin D3.The Th17 cell and CD4+Treg cells in the peripheral blood mononuclear cell were detected by flow cytometry.ResultsCompared with normal controls [(31.87±5.97)ng/ml], the peripheral blood 25-hydroxyvitamin D3 concentrations decreased significantly in patients with hepatitis B cirrhosis[(11.89±6.04)ng/ml,t=9.510,P=0.001]. The percentage of Th17 cells was higher in patients with hepatitis B cirrhosis than that of normal controls(2.498%±2.583%vs0.913%±0.216%). In hepatitis B cirrhosis patients, the percentage of CD4+Treg cells was lower than that of healthy controls(2.333%±1.714%vs3.964%±1.116%). Compared with normal controls,the ratio of Th17/Treg increased in patients with hepatitis B cirrhosis(0.256±0.138vs1.199±0.973,P<0.05).ConclusionIn patients with hepatitis B cirrhosis,the peripheral blood 25-hydroxyvitamin D3 concentration decreases, Th17 cells increases, CD4+Treg cells decreases and the ratio of Th17/Treg increases. There are the immune disorders of CD4+Treg cells, Th17 cells and the ratio of Treg/Th17 in hepatitis B cirrhosis patients. Increased peripheral blood level of 25-hydroxyvitamin D may adjust immune status of hepatitis B cirrhosis.

liver cirrhosis; 25-hydroxyvitamin D3; CD4+Treg cells; Th17 cells

王玲,女,1968-12生,学士，副主任医师,E-mail:983095232@qq.com

2017-11-19

R512.6

A

1007-6611(2017)12-1233-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.007