玛咖提取物对运动耐力和脊神经元线粒体超微结构的影响*

俞发荣，杨 博，李作平，连秀珍，谢明仁，李登楼，张诗爽

玛咖提取物对运动耐力和脊神经元线粒体超微结构的影响*

俞发荣1，杨 博1，李作平2△，连秀珍1，谢明仁1，李登楼1，张诗爽1

（1.甘肃政法学院甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室，2.体育教学部，兰州730070）

目的：探索玛咖提取物对运动耐力和脊神经元线粒体超微结构的影响。方法：50只Wistar大鼠随机分为5组。对照组：不进行游泳，灌胃等量蒸馏水；单纯游泳组：游泳，灌胃等量蒸馏水，玛咖提取物组（设4.0，5.3，8.0 g／kg 3个剂量组）：游泳，给予相应剂量的玛咖提取物。游泳大鼠在游泳池内循环水流自由游泳，连续游泳并给药15 d，第16天游泳耐力测试后无痛处死大鼠，用投射电子显微镜观察脊髓神经元线粒体超微结构，放免法测定肌肉肌糖元、检测肌肉中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和游离钙水平。结果：与单纯游泳组比，沉下前游泳时间和游泳总时间分别延长了（%）19.83、60.28、77.55和 55.34、73.91、94.47，差异均有统计学意义（P均＜0.01）；沉下次数分别减少了（%）34.35、51.18、57.96，差异有统计学意义（p＜0.01）；MDA和游离钙含量分别降低了（%）20.10、31.49、38.72，差异有统计学意义（p＜0.01）和 6.42、17.58、26.35；SOD、GSH-Px和肌糖原含量分别升高了（%）5.12、22.74、52.53、44.22、77.79、98.45，差异有统计学意义（p＜0.01）和 35.08、47.83、81.88，差异有统计学意义（p＜0.01）；脊神经元线粒体的体密度（Vd）、面密度（Sd）和数密度（Nd）分别减小了（%）7.79、18.18、31.17，16.95、27.34、43.31和 13.51、23.19、43.15。结论：玛咖提取物具有保护脊髓神经元线粒体结构、抗氧化、增加肌糖原和提高运动能力等作用。

玛咖提取物；运动耐力；线粒体；Wistar大鼠

玛咖（Maca），十字花科（Brassicaceae）独行菜属（Lepidium）植物，是一种药食两用植物资源，营养成份丰富，有“南美人参”之誉。在中、南美洲国家、如厄瓜多尔、秘鲁、墨西哥等国玛咖作为民间药物用于增强精力、提高生育力、缓解更年期综合症、抑郁症、哮喘症和促进伤口愈合等。在美国、欧洲、日本、台湾、澳大利亚等国际科学研究者也加快了对玛咖化学成分、药效药理研究的步伐，每年都在不断揭开产生玛咖神奇功效的神秘面纱，这就给玛咖具有独特药效的医药产品的开发奠定了坚实的基础。为了探索玛咖抗疲劳、增加运动能力的机制，本文以Wistar大鼠为实验对象，给予玛咖提取物结合游泳，观察玛咖提取物对大鼠游泳时间、抗氧化作用、脊神经元超微结构的影响，为研究运动疲劳机制和玛咖的开发利用积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

玛咖提取物：称取云南玉龙雪山产的玛咖块根500 g，加水 1500 ml，得煎液 900 ml，再隔水加热浓缩为 200 ml（含生药 2.5 g／ml），实验时用蒸馏水稀释成所需浓度。

实验动物及实验环境：SPF级 Wistar大鼠（雄性），体重180 g～190 g，购于甘肃省中医学院科研实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2011-0001。全部实验均在甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室SPF级动物实验室完成，实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2015-0006。

试剂：MDA、SOD、GSH-Px、Free Ca2+试剂盒购于南京建成生物工程研究所（批号20150306），肌糖原检测试剂盒购于江苏晶美生物科技有限公司（20150507）。

仪器：酶联免疫检测仪，购于上海雷勃分析仪器有限公司（MULTISKAN MK3）；ZHJH-C1112B型双人单面百级超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司。TEM-1200EX／s型投射电子显微镜，日本，JEOL公司。

1.2 动物分组

50只Wistar大鼠（雄性）采用抓阄法随机分组。对照组（C）：10只，正常饲养，不进行游泳，灌胃（ig）等量蒸馏水；单纯游泳组（s）：10只，游泳，ig等量蒸馏水；玛咖提取物组：30只［按玛咖最大耐受量（320 g／kg体重）的 1／40、1／60、1／80给药量分为低剂量组（ML）10只、中剂量组（MM）10只、高剂量组（MH）10只］：游泳，分别 ig玛咖提取物 4.0、5.3、8.0 g／kg体重。每天1次，连续15 d。

1.3 游泳训练实验

游泳组动物每天游泳1次，游泳水速0.8 m／s，水温22～24℃。首次游泳30 min，每天递增5 min，连续游泳15 d。

1.4 游泳耐力测试

实验第16天，进行游泳耐力测试。为了缩短测试时间，每只大鼠尾部负重10 g砝码进行游泳，以动物沉入水下停留10 s为止。

1.5 肌肉 MDA、SOD、GSH-Px测定

实验第16天，乙醚吸入无痛死亡，剥取左右后肢股四头肌，置于冰冷生理盐水中洗净血液，用滤纸吸干，置于EP管内，放于-80℃低温冰箱内冷藏，备用。称取肌肉120 mg，放入盛有冰冷生理盐水的烧杯内，用眼科剪碎肌肉组织，倒入玻璃匀浆管中，充分研碎，使组织匀浆化，将匀浆放入低温低速离心机2 000 r／min，离心15 min。将离心好的匀浆取上清液于Eppendorf管中，以丙二醛（MDA）含量作为LPO水平指标。分别按 MDA、SOD、GSH-Px试剂盒操作说明测定其含量。

1.6 肌糖原测定

取肌肉120 mg，剪碎肌肉组织，加缓冲液（210 mmol／L蔗糖，2 mmol／L EGTA，40 mmol／L NaCl，30 mmol／L hpes，pH 7.4，蛋白酶抑制剂）3 ml，置试管内冰水浴中，用玻璃匀浆器制成匀浆，3 000 r／min离心5 min，取上清液1 ml加入试管中，放于-80℃低温冰箱内冷藏，备用。按肌糖原试剂盒操作说明测定其含量。

1.7 脊神经元线粒体超微结构测定

剥取大鼠脊髓腰膨大段放入含4%多聚甲醛-1.25%戊二醛 0.1 mol／L磷酸缓冲液（pH 7.4）固定液固定24 h，切片，经锇化，梯度酒精脱水，Epon812平板包埋，超薄切片，经醋酸铀-枸橼酸铅双重染色，TEM-1200EX／s型透射电镜观察照相。采用Weibel点计数法，计算脊髓运动神经元线粒体的体密度（volume density，Vd）：

注：体密度（Vd），是单位细胞质内线粒体所占的体积；pxi为第i张照片中待测线粒体内的测试点数；pri为i张照片中参照系的测试点数。

数密度（numeral density，Nd）：

注：数密度（Nd），是单位胞质体积中线粒体的数目；K为大小分布系数；NA是线粒体截面数目和细胞质截面面积的比值。

面密度（superficial density，Sd）：

注：面密度（Sd），是单位胞质体积中线粒体外膜面积的数量；Ix是线粒体外膜截线与测试线的交点数Pr是参照系平面内的测试点数Z是测试格中一个测试点所代表的测试线长。

1.8 统计学处理

实验数据用均数±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。玛咖提取物对游泳大鼠生理指标的影响用单因素方差分析（one way，ANOVA）。

2 结果

2.1 玛咖提取物对大鼠游泳时间的影响

游泳耐力实验结果表明，分别ig玛咖提取物4.0、5.3、8.0 g／kg体重，沉下前游泳时间比单纯游泳组分别延长了 19.83%、60.28%、77.55%，游泳总时间分别延长了 55.34%、73.91%、94.47%，随给药剂量的增加而延长；沉下次数比单纯游泳组分别减少了34.35%、51.18%、57.96%，随给药剂量的增加而减少；差异均有统计学意义（P均＜0.01，表1）。

Tab.1 Effects of the maca extract on swimming time of rats（¯x±s，n＝10）

2.2 玛咖提取物对游泳大鼠肌肉 MDA、SOD、GSH-Px、游离钙和肌糖原水平的影响

分别 ig玛咖提取物 4.0、5.3、8.0 g／kg体重，游泳耐力检测，大鼠肌肉MDA含量比单纯游泳组分别降低了 20.10%、31.49%、38.72%，游离钙分别降低了6.42%、17.58%、26.35%；随给药剂量的增加而降低；大鼠肌肉 SOD含量分别升高了 5.12%，22.74%、52.53%；GSH-px分别升高了 44.22%，77.79%、98.45%，肌糖原分别升高了 35.08%、47.83%、81.88%，随给药剂量的增加而升高；差异均有统计学意义（P均＜0.01，表2）。

Tab.2 Effects of maca extract on the levels of muscle MDA，SOD，GSH-Px，Ca2+and muscle glycogen in swimming rat（¯x±s，n＝10）

2.3 玛咖提取物对大鼠脊神经元线粒体超微结构的影响

分别 ig玛咖提取物 4.0、5.3、8.0 g／kg体重，游泳耐力检测，大鼠脊神经元线粒体的体密度（Vd）比单纯游泳组分别减小了 7.79%、18.18%、31.17%，面密度（Sd）分别减小了 16.95%、27.34%、43.31%，数密度（Nd）分别减小了 13.51%、23.19%、43.15%，随给药剂量的增加而减小；游泳组大鼠脊神经元线粒体的各项参数均大于对照组；差异均有统计学意义（P均 ＜0.01，表 3）。

3 讨论

适量的体育运动对人们的身心健康是有益的［1］，耐力训练能使机体抗氧化酶和线粒体产生适应性变化［2］，降低心肌凋亡水平［3］，增强主动脉血管抗炎能力，从而发挥抗疲劳的作用［4］，缓减衰老骨骼肌的氧化应激［5］。过度运动将引起心脏生物电改变［6］，诱发心肌损伤［7］，引起肌肉运动能力下降，导致运动性疲劳。近年来，研究人员从不同的角度对运动性疲劳进行了大量的实验研究，提出运动应激性代谢产物是运动性疲劳发生的根本原因之一［8］。如脂质过氧化（LPO）水平增高使代谢产物丙二醛（MDA）［9］和 Ca2+［10］的堆积，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性下降，能源物质减少［11］，神经系统［12］、心血管系统［13］功能的改变，导致运动肌肉收缩和舒张功能障碍、运动能力下降，即发生疲劳。为了寻求抗疲劳药物，将参杞制剂［14］或杜仲多糖［15］给予游泳小鼠，均能明显提高肝糖原、肝脏SOD和GSH-Px含量，延长小鼠力竭游泳时间，并具有较强的抗疲劳与抗氧化作用。张静等［16］将玛咖粉给予训练小鼠，显著缓解了疲劳，延长了小鼠爬杆的时间（p＜0.01）和力竭游泳时间（p＜0.01）［17］。本文实验结果发现，力竭运动，使骨骼肌细胞脂质过氧化（LPO）水平增高，LPO不仅调节Ca2+-ATP酶产生影响，造成细胞浆中Ca2+的堆积，影响骨骼肌纤维的兴奋收缩偶联；骨骼肌MDA含量升高，使SOD、GSH-Px活性降低，脊神经元线粒体超微结构发生变化甚至损伤，影响线粒体呼吸链ATP的释放，导致骨骼肌肉的工作能力下降而产生疲劳。给予玛咖提取物游泳组大鼠骨骼肌MDA和游离钙明显降低，骨骼肌糖原含量、SOD和GSH-Px活性明显升高，大鼠脊神经元线粒体参数明显改善，运动耐力显著增强。实验结果提示，玛咖提取物能降低骨骼肌MDA的生成，提高骨骼肌SOD、GSH-Px活性，保护脊神经元线粒体结构和增强运动能力的作用。实验结果为进一步研究探索运动疲劳机制提供了参考依据。

Tab.3 Effects of maca extract on mitochondrial ultrastructure of rat spinal nerve cells（¯x±s，n＝10）

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Effects of the maca extract on the ultrastructures of mitochondria in the spinal nerve cell and exercise endurance

YU Fa-rong1，YANGBo1，LI Zuo-ping2△，LIAN Xiu-zhen1，XIE Ming-ren1，LI Deng-lou1，ZHANG Shi-shuang1
（1.Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application，2.Department of Physical Education，Gansu Institute of Political Science and Law，Lanzhou 730070，China）

Objective：To investigate the effects of maca extract on the ultrastructures of mitochondria in the spinal nerve cell and exercise endurance.Methods：The Wistar rats were randomly divided into 5 groups，including the control group（no swimming），the swimming group（free swimming），and 3 treatment groups treated with the maca extract at the doses of 4.0，5.3 and 8.0 g／kg body weight.The animals in swimming and treatment groups were then for free swimming in the circulating water flow daily for 15 days.On the 16thday after swimming endurance，the spinal and muscular tissues were collected from all groups.The mitochondrial ultrastructures of the neurons of the spinal cells wereobserved with the projection electron microscope，and the levels of the glycogen，malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），and Ca2+in muscle tissues were determined by the RIA method.Results：When rats were treated with maca extract（at 4.0，5.3，8.0 g／kg body weight），the total swimming time and the swimming duration before sinking were increased by 19.83%，60.28%，77.55%，and 55.34%，73.91%，94.47%，respectively，compared with the simple swimming group（p＜0.01），while the sinking times were decreased by 34.35%，51.18%and 57.96%，compared with those of the swimming group.Also，the levels of SOD，GSH-Px，and muscle glycogen in three treatment groups were enhanced by 5.12%，22.74%，52.53%，44.22%，77.79%，98.45%（p＜0.01），and 35.08%，47.83%，81.88% （p＜0.01）respectively over the swimming rats without treatment，but the MDA content and the Ca2+levels were reduced by 20.10%，31.49%38.72%，and 6.42%，17.58%，26.35%，compared with the simple swimming group（p＜0.01）.In addition，compared to the swimming group，the mitochondrial densities of volume（Vd），surface（Sd）and numbers（Nd）of spinal nerve cells in rats treated with maca extract（4.0，5.3，8.0 g／kg body weight）were reduced by 7.79%，18.18%，31.17%，16.95%，27.34%，43.31%and 13.51%，23.19%，43.15%，respectively.Conclusion：Our results demonstrated the protective effects of maca extract on the mitochondria of spinal cell and suggested that maca extract could improve the muscle antioxidant activity by increasing the levels of SOD，GSH-Px，and muscle glycogen.

maca extract； movement endurance； mitochondria； Wistar rats

Q95.33

A

1000-6834（2017）06-535-05

10.12047／j.cjap.5481.2017.127

甘肃省基础研究创新群体项目（145RJIA333）；兰州市科技计划项目（2014-1-182；2015-3-80）；甘肃省高校科技创新团队项目（2016C-09）；兰州市人才创新创业项目（2016-RC-85）；西北民族地区侦查理论与实务研究中心项目；甘肃政法学院重大项目（2016XZD15）；甘肃政法学院 “文翰学者”项目

2016-07-28

2017-05-15

△【通讯作者】Tel：18189651683；E-mail：tim9898＠163.com