Box-Behnken效应面法优化泰山紫草中总萘醌提取工艺

王新慧 李 伟 张燕芸 吕丽静 曲晓兰

(泰山医学院药学院,山东 泰安 271016)

Box-Behnken效应面法优化泰山紫草中总萘醌提取工艺

王新慧 李 伟 张燕芸 吕丽静 曲晓兰

(泰山医学院药学院,山东 泰安 271016)

目的 优选泰山紫草总萘醌的提取工艺。方法 在单因素试验基础上，采用Box-Behnken效应面法，以总萘醌的提取率为指标，考察乙醇体积分数、提取时间、料液比等的影响，利用紫外分光光度计测定总萘醌的含量。结果 确定泰山紫草中总萘醌的最佳工艺为：乙醇体积分数80%，提取时间30 min，料液比1∶18，提取2次，总萘醌的提取率为3.384%。结论 Box-Behnken效应面法用于泰山紫草中总萘醌提取工艺条件的优选是可行的，模型预测效果较好。

泰山紫草；总萘醌；Box-Behnken效应面法；提取工艺

泰山紫草为泰山“四大名药”之一，为紫草科植物紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.)的干燥根，具有活血、凉血、清热解毒、消炎杀菌等功效[1]。紫草药理作用广泛, 具有抗炎抗菌、抗肿瘤、抗艾滋病、抗炎、保护肝脏、抗氧化、降血糖、改善微循环系统功能等作用[2]。萘醌类化合物是泰山紫草主要有效成分之一, 易溶于氯仿、石油醚,可溶于乙醇,微溶于水，对热不稳定[3]。综合考虑各方面因素,本实验采用超声法提取泰山紫草中总萘醌类成分，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken效应面法，优化泰山紫草总萘醌的提取工艺，为泰山紫草中总萘醌的提取工艺提供技术参数。

1 仪器与试剂

KQ-5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-2550型紫外—可见分光光度计(日本岛津)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；FC-104电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)。泰山紫草(购自于泰山四大名药开发有限公司),经泰山医学院药学院苏延友教授鉴定为为紫草科植物紫草的干燥根。左旋紫草素对照品(批号110769-200405，中国药品生物制品检定所),水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1供试液的制备

2.1.1对照品溶液的制备 精确称取左旋紫草素对照品0.0025 g,置于容量瓶中,用无水乙醇溶解,定容至50 ml,得到浓度为0.05 mg·ml-1的对照品储备液，备用。

2.1.2泰山紫草总萘醌的提取 称取干燥后的泰山紫草粗粉(10目)样品粉末10.00 g，置圆底烧瓶中，在一定的乙醇体积分数、提取时间、料液比条件下，超声法提取总萘醌，提取液冷却浓缩，离心，取上清液置于量瓶中，乙醇定容至50 ml，作为待测液。

2.2总萘醌的测定

2.2.1标准曲线的制备 精密量取左旋紫草素对照品液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml分别置于的容量瓶中,用无水乙醇定容至10 ml,摇匀。在516 nm处测定吸光度,并以吸光度为纵坐标(Y),左紫草素对照品浓度为横坐标(X),做回归曲线,得回归方程Y=24.946X-0.0059,r=0.9994,结果表明，左旋紫草素的质量浓度在5～25 mg·ml-1的范围内与吸光度呈现出良好的线性关系。

2.2.2泰山紫草中总萘醌的含量测定 精密量取上述样品供试液2 ml，按“2.2.1”项下的操作方法，再计算出样品中总萘醌的量。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验 精密量取左旋紫草素对照品液2 ml，置于10 ml的容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀，按“2.2.1”项下的方法测定待测溶液在516 nm处的吸光度，RSD=2.32%(n=6)，结果表明实验仪器精密度良好。

2.3.2稳定性试验 精密量取同一供试品溶液2.0 ml，按“2.2.1”项下方法操作，于0 h,0.5 h,1.0 h,2.0 h,4.0 h,6.0 h，8.0 h测定吸光度，计算 RSD=1.71%，结果表明供试液在8 h内稳定。

2.3.3重复性试验 取同一泰山紫草提取液6份，每份2 ml，按“2.2.1”项下方法操作，测定溶液在516 nm处的吸光度，计算RSD=2.89%，表明该方法的重复性良好。

2.3.4加样回收率试验 取已知含量的泰山紫草提取液6份，每份加入左旋紫草素对照品液1 ml，按照“2.2.1”项下方法操作，测定溶液在516 nm处的吸光度，测得平均回收率为98.92%，计算RSD=1.53%。

2.4单因素试验

2.4.1提取时间对泰山紫草总萘醌提取率的影响 称取泰山紫草粗粉5份，每份5.0 g，分别加入10倍量的80%乙醇溶液，分别超声辅助提取5 min、10 min、15 min、30 min和45 min，按“2.2.1”项下操作，于516 nm处测定提取液吸光度，并计算出总萘醌的含量，结果见图1。如图所示随着提取时间的延长，总萘醌提取量随之增加，当提取时间为30 min时达到最大值，之后，总萘醌的提取量趋于稳定，故选取提取时间为30 min。

表1 因素与水平表

表2 设计方案及结果

表3 方差分析结果

图1 提取时间与提取率的关系

2.4.2乙醇体积分数对泰山紫草总萘醌提取率的影响 称取泰山紫草粗粉6份，每份5.0 g，分别加入10倍量的50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液超声提取15 min，按“2.2.1”项下操作，于516 nm处测定提取液吸光度，并计算出总萘醌的含量，结果见图2。随着乙醇体积分数的升高泰山紫草总萘醌的提取率也增大,当乙醇得体积分数为80%时，总萘醌的提取率为最大值，随着乙醇体积分数的增高，总萘醌的提取率开始下降。因此, 确定提取时选择乙醇体积分数在80%左右。

图2 乙醇体积分数与提取率的关系

2.4.3料液比对泰山紫草总萘醌提取率的影响 称取泰山紫草粗粉5份，每份5.0 g，分别用5、10、15、20、30倍体积的80%乙醇溶液，分别超声提取15 min，按“2.2.1”项下操作，于516 nm处测定提取液吸光度，并计算出总萘醌的含量，结果见图3。随着料液比体积的增加，总萘醌提取率也随之增加，当溶剂达到一定量之后，再增加溶剂的量，对总萘醌提取率影响不大，由于加大溶剂的量，会提高提取的成本，故料液比选择15倍体积。

图3 料液比与提取率的关系

2.4.4提取次数对泰山紫草总萘醌提取率的影响 称取泰山紫草粗粉3份，每份5.0 g，分别用15倍体积的80%乙醇溶液，分别超声辅助提取20 min，分别提取1,2,3次，按“2.2.1”项下操作，于516 nm处测定提取液吸光度，并计算出总萘醌的含量。随着提取次数的增加，总萘醌提取率也随之增加，提取次数为2次和3次的总萘醌提取率非常相近，说明总萘醌提取率已经接近最高，考虑到随着提取次数的增加，溶剂的使用量也增加,溶剂回收成本增高,且随着提取次数增加,杂质成分也随之增多,会影响泰山紫草总萘醌的提取效果，综合考虑,确定提取2次较为合理。

2.5工艺优化试验

2.5.1实验设计与结果 在前期单因素试验的基础上，根据效应面实验设计原理，以泰山紫草总萘醌提取率为响应值，选择乙醇体积分数、提取时间和液料比为考察因素，每个因素设三个水平，试验水平因素安排见表1，设计方案及结果见表2。

2.5.2模型拟合[4]以泰山紫草总萘醌提取率为响应值，采用Design Expert软件对试验结果进行回归分析，得到乙醇体积分数、提取时间和液料比对总萘醌提取率影响的二项式方程，拟合后，得到回归模型方程为：Y=3.2720+0.2038 A+0.2163 B+0.2450 C+0.1100 AB-0.0325 AC+2.500 BC-0.3435 A2-0.2835 B2-0.1260 C2。

对该模型进行回归方差分析和显著性检验，结果见表3。

由表3可知，该模型P<0.0001，表明实验所得的回归模型方程极显著。在本实验设定的区域范围内，乙醇体积分数、提取时间和料液比的P值均<0.001，对总萘醌得率的影响极显著。乙醇体积分数二次项和提取时间二次项和的P值均<0.0001，料液比二次项P值<0.01，整体模型P值<0.0001达到极显著水平，失拟项不显著，说明该模型拟合性较好。

2.5.3效应面优化和预测 根据回归模型方程，将乙醇体积分数、料液比和提取时间对泰山紫草总萘醌提取率的影响绘制成响应面图4。

图4 乙醇体积分数、料液比和提取时间对总萘醌提取率的响应面图

由图4可知，对乙醇体积分数对总萘醌提取率的影响最为显著，其次是提取时间，料液比对总萘醌提取率的影响最小。根据模型分析结果及相应的响应面图和等高线图，确定总萘醌提取的最佳工艺条件：乙醇体积分数为82.76%，料液比为1∶17.73(g·ml-1)，提取时间为 32.25 min，提取2次。根据实验操作的可行性，将提取工艺修正为：乙醇体积分数为80%，料液比为1∶18(g·ml-1)，提取时间为30 min，超声提取2次。 在此条件下，测得总萘醌提取率为3.384%(n=5，RSD=1.09%)，与理论预测值3.371%接近，说明该模型能较真实地反映各因素对总萘醌提取率的影响，模型方程可靠，具有实用价值。

3 讨 论

本实验通过单因素分别考察了提取时间、乙醇体积分数、料液比和提取次数对总萘醌提取率的影响，确定了影响得率的主要因素。由于星点设计-响应面优化法是采用非线性数学模型拟合，并在中心点进行重复性试验，可以提高实验精确度，更好地体现各因素、指标与效应值的关系等特点[5]，故本实验采用Box-Behnken效应面法设计响应面实验，建立了模型，并通过方差分析，得出各个因素之间的交互作用都较强，影响泰山紫草总萘醌得率的因素依次为主次关系依次为乙醇体积分数，提取时间，料液比。实验确定了提取总萘醌的最佳工艺条件，即乙醇体积分数为80%，料液比为1∶18(g·ml-1)，提取时间为30 min，提取2次。该模型准确有效。

[1] 王光辉,王琦,时元林.泰山四大名药[J].山东中医杂志, 2006, 25(3):203-204.

[2] 贺锐锐，刘永刚，魏敏吉，等.紫草组分的抗肿瘤活性及其凋亡机制研究[J].中国临床药理学杂志,2012,28(1)：43-45.

[3] 戴冰,冷旺,邹双华,等.新疆软紫草系统溶剂法提取工艺研究[J].中成药,2008,30(10):1461-1464.

[4] 兰艳素，李长江，宋坤鹏，等．星点设计-效应面法优化百蕊草总黄酮提取工艺[J].中成药，2014,36(12):2629-2632.

[5] 刘艳杰,项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J].中国现代应用药学杂志,2007,24(6):455-457.

Optimization of extraction technology for total naphthoquinones from lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc. by Box-Behnken design

WANGXin-huiLIWeiZHANGYan-yunLIULi-jingQUXiao-lan

(Pharmacy College,Taishan Medical University,Taian 271016,China)

Objective: To optimize the extraction technology for total naphthoquinones from Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc by Box-Behnken design.Methods:Based on the results of single-factor experiment, Box-Behnken experimental design combined with response surface methodology was employed, investigatine the ethanol concentration, solid-liquid ratio,and extraction time affecting the extraction process,the extraction rate of total naphthoquinones indicators. The total naphthoquinone content by UV spectrophotometer.Results: The optimization processing parameters was as follows: ultrasonic extracted 30min with 18 times the amount of 80% ethanol and extract twice, respectively. The extraction rate of total naphthoquinones was 3.384%. Conclusion:Box-Behnken experimental designis feasible, and highly predictive.

Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc;total naphthoquinones;Box-Behnkend-design; extraction process

山东省教育厅科技计划项目(编号：J16LM10)；山东省中医药科技发展计划项目(编号：2013255)；泰山地产中药研发协同创新中心基金(编号：zd099)。

王新慧，女，2013级中药学专业在校本科生。

曲晓兰，女，硕士，副教授，主要从事中药药效物质基础研究。

R931.6

A

1004-7115(2017)12-1324-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.002

2017-08-05)