杏仁及杏仁皮多酚超声提取优化及抗氧化能力差异性研究

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(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002)

杏仁及杏仁皮多酚超声提取优化及抗氧化能力差异性研究

刘梦培,铁珊珊,张丽华,王小媛,唐银华,纵伟*

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002)

为获得杏仁及杏仁皮内多酚提取的最优方案，采用超声波处理样品，以料液比、超声温度、功率和时间为影响因素多酚得率为指标进行研究。结果表明：杏仁多酚超声提取最佳条件为料液比1∶10、超声温度50 ℃、超声功率400 W,超声时间60 min。而杏仁皮多酚超声提取最佳条件为料液比1∶10、超声温度60 ℃、超声功率400 W,超声时间60 min。采用还原力、OH、DPPH和ABTS自由基清除率四个抗氧化能力指标对杏仁及杏仁皮多酚的抗氧化能力进行差异性分析,以期为杏仁多酚这一功能性成分的开发提供参考依据。研究结果表明,杏仁多酚抗氧化能力大小与其含量成正比。甜杏仁多酚的还原力、OH和ABTS自由基清除率均高于苦杏仁多酚,而甜苦杏仁多酚的DPPH自由基清除率接近一致,且在0.024 mg/mL浓度时依次为25.4%和23.7%。甜苦杏仁皮多酚抗氧化能力差异不明显,其还原力、DPPH和ABTS自由基清除率三者基本一致,而在0.24 mg/mL浓度时,甜杏仁皮多酚的OH自由基清除率约为苦杏仁皮的2倍。总体来说,甜杏仁多酚的抗氧化能力优于苦杏仁多酚,潜在利用价值更高。

杏仁,杏仁皮,多酚,抗氧化能力

仁用杏是以杏仁为主要产品的蔷薇科杏属植物,有甜苦之分。杏仁营养价值丰富,其蛋白质含量丰富,总蛋白高达35%,油脂的不饱和脂肪酸含量高达95%左右,其中油酸的含量与橄榄油相近,达70%以上[1-2];另外,它富含约6.1%苦杏仁甙,在抗癌方面具有显著的药用价值[3]。近年来,氧化与抗氧化,衰老与抗衰老已成为食品科学、营养科学研究的热点。活性氧自由基攻击生命大分子,导致蛋白质损伤、酶失活、膜脂过氧化、碳水化合物和核酸损伤,从而引起机体衰老或病理性疾病。流行病学的研究表明,食用富含抗氧化成分的水果和蔬菜可以有效降低这些慢性疾病发生的概率。果蔬多酚的含量与抗氧化能力之间存在显著的相关性[4-6]。天然酚类化合物是植物体内最丰富的次生代谢产物。植物多酚具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抑菌和调节免疫功能等多种生理和药理活性,被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域[7-10]。仁用杏作为我国重要的木本粮油树种,其杏仁的抗氧化能力主要来自于多酚。

目前，我国仁用杏产业还处于粗放阶段，针对杏仁的研究主要集中在杏仁产品的开发和工艺方面，而对杏仁的生物活性功能，尤其是抗氧化作用进行深入的研究不多，已开展的研究仅仅局限在杏仁油多酚、杏仁皮黄酮方面[11-12]。例如，黄丽华等通过超声辅助提取三种杏仁中的黄铜，发现其都具有较强的抗氧化性能[13]；王妙飞等研究发现采用超声波辅助提取马尾松松塔中的多酚，乙醇浓度为65%，超声时间30 min，超声功率40 W条件下多酚得率最高[7]。因此，本文采用超声提取杏仁及杏仁皮中的多酚。另外，针对甜苦杏仁之间的差异性研究开展较少。

本研究以杏仁和杏仁皮资源为研究材料,一方面优化多酚超声提取的最佳工艺,另一方面比较甜苦杏仁多酚抗氧化能力差异性,以期为杏仁多酚这一天然的抗氧化剂的深入利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

甜杏仁主栽品种‘龙王帽’和苦杏仁主栽品种‘山杏’ 中国林科院仁用杏种质资源圃;1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)、2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulph-onic acid)acid diammonium salt(ABTS)、没食子酸(标准品) Sigma公司;葡萄糖、维生素C(VC)、硫酸、正丁醇、氯仿、磷酸钠、钼酸铵、无水乙醇 北京化工厂;以上试剂 均为分析纯。

KQ-100型超声仪 昆山市超声仪器有限公司;EV 311旋转蒸发仪 北京莱伯泰科仪器公司;OptimaL-80 XP离心机 贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司;UV-120-02紫外分光光度计 日本Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜杏仁及杏仁皮超声提取工艺优化 本研究选择超声提取多酚。以甜杏仁及杏仁皮为研究材料,以70%的无水乙醇为提取溶剂,将干燥的杏仁/杏仁皮粉碎过80目筛,称取5.00 g,采用L9(34)正交实验设计进行超声提取(表1),优化的四因素依次为料液比(X1)、超声温度(X2)、超声功率(X3)和超声时间(X4),以多酚得率为评价指标,寻找最佳提取工艺。3次平行重复实验(苦杏仁及杏仁皮多酚的提取采取甜杏仁超声优化的最佳条件)。

多酚得率(mg/g)=(V×C)/m

式中:m：称取的样品质量(g);V：样品多酚提取液的体积(mL);C：样品中的多酚含量(mg/mL)。

表1 因素水平表Table 1 Factor and levels table

测定总酚的方法见参考文献[13-14]。以没食子酸为标准品,绘制标准曲线。总酚的标准曲线为:吸光度值x与没食子酸标准溶液浓度(y,mg/mL)之间的回归方程为:y=0.786x+0.008,(R2=0.9995)。

1.2.2 杏仁及杏仁皮多酚抗氧化能力评价

1.2.2.1 还原力的测定 主要参考李顺峰的方法[15]。取样品溶液1 mL,加入pH=6.6,0.2 mol/L磷酸缓冲液2.5 mL,1%铁氰化钾2.5 mL,50 ℃保温20 min,急剧冷却加入10%三氯乙酸2.5 mL,3000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL去离子水,再加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL,反应30 min,700 nm下测吸光度。

1.2.2.2 OH自由基清除率的测定 主要参考Li的方法[16]。取样品溶液0.5 mL,依次加6 mmol/L的FeSO4和6 mmol/L水杨酸-乙醇各1 mL。混匀后静止10 min,加入8.8 mmol/L H2O20.5 mL启动反应,避光静置0.5 h,510 nm下测吸光度。

OH清除率(%)=1-(A1-A2)/A0×100

式中:A1:样品的吸光度,A2:以蒸馏水代替H2O2作样品本底吸收度,A0以蒸馏水为对照。

1.2.2.3 DPPH自由基清除能力的测定 主要参考Suttirak的方法[17]。取2 mL样品,加入2 mL DPPH(2×10-4mol/L)溶液混合均匀,黑暗处反应30 min,以无水乙醇调零,测定517 nm处吸光值。

DPPH自由基清除率(%)=1-(A1-A2)/A3×100

式中:A1:样品的吸光度,A2:以乙醇代替DPPH吸光度为空白,A3:以乙醇代替样品为对照。

1.2.2.4 ABTS自由基清除能力的测定 主要参考Miller的方法[18]。ABTS自由基的制备:固体的ABTS溶解于水中配成7 mmol/L溶液,将7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液混合(1∶0.5),置室温黑暗条件下放置12～16 h后备用。使用前用无水乙醇稀释至吸光值在734 nm处为0.70+0.02。测量:100 μL样品提取液加到3 mL ABTS自由基溶液中避光反应6 min后,在734 nm处测定吸光值。

ABTS自由基清除率(%)=1-(Ax-Ax0)/A0×100

式中:Ax:加入样品后溶液吸光度,Ax0:样品溶液本底吸光度,A0:空白。

表3 杏仁多酚提取的方差分析Table 3 ANOVA for the extraction of kernel polyphenol

注:**表示极显著(p<0.01)；表5同。

1.2.3 数据分析 利用SPSS 22.0软件对杏仁/杏仁皮多酚提取条件进行极差分析、方差分析(ANOVA)和多重比较;利用Origin Pro 8.5软件进行杏仁/杏仁皮多酚抗氧化能力作图分析。

2 结果与分析

2.1 甜杏仁及杏仁皮超声提取条件筛选

2.1.1 甜杏仁超声提取最佳条件 通过极差分析发现(表2),对杏仁多酚提取得率影响因素大小依次为:超声温度(X2)>料液比(X1)>超声功率(X3)=超声时间(X4)。杏仁多酚超声提取的最优条件为料液比1∶10、超声温度50 ℃、超声功率400 W,超声时间60 min,此时多酚得率0.0297 mg/g。而方差分析的结果显示(表3),四个因素间,料液比、超声温度、超声功率和超声时间各自对多酚含量均产生了极显著差异。

表2 杏仁多酚提取的正交实验结果Table 2 Orthogonal test result of the extraction of kernel polyphenol

2.1.2 甜杏仁皮超声提取最佳条件 杏仁皮多酚提取条件优化结果见表4和表5。通过极差分析发现,对杏仁皮多酚提取得率影响因素大小依次为:料液比(X1)>超声功率>(X3)>超声温度(X2)>超声时间(X4)。杏仁皮多酚超声提取的最优条件为料液比1∶10、超声温度60 ℃、超声功率400 W,超声时间60 min,此时多酚得率0.1498 mg/g。而方差分析结果显示,四个因素间,超声温度、超声功率和超声时间对多酚得率差异均不显著,仅料液比之间的三个水平1∶20、1∶15和1∶10之间对多酚得率存在极显著差异。

表4 杏仁皮多酚提取的正交实验结果Table 4 Orthogonal test result of the extraction of kernel seedcase polyphenol

2.2 抗氧化能力差异性分析

2.2.1 杏仁多酚抗氧化能力差异性分析 杏仁多酚的抗氧化能力见图1。甜苦杏仁多酚的四个抗氧化能力指标均随着多酚浓度的增大而增高。还原力的测定表明,在0～0.024 mg/mL的较低浓度范围,还原能力很弱,而甜杏仁多酚的还原力较高于苦杏仁多酚。在0.024 mg/mL浓度时,甜苦杏仁多酚的还原力分别为0.079和0.044。在0～0.016 mg/mL的浓度范围内,甜杏仁多酚的还原能力甚至高于VC,而在0.016～0.024 mg/mL浓度范围内,甜杏仁多酚的还原能力远低于VC。

表5 杏仁皮多酚提取的方差分析Table 5 ANOVA for the extraction of kernel seedcase polyphenol

图1 杏仁多酚的抗氧化能力差异性比较Fig.1 Different of antioxidant activity of kernel polyphenol 注:A:还原力;B:OH自由基清除率;C:DPPH自由基清除率;D：ABTS自由基清除率；图2同。

OH自由基清除率的测定表明在0～0.024 mg/mL的较低浓度范围,甜杏仁的OH自由基清除率高于苦杏仁,且均高于VC。在0.024 mg/mL浓度时,甜苦杏仁多酚的OH自由基清除率分别为85.3%和55.4%。

DPPH自由基清除率的测定显示在0～0.024 mg/mL的较低浓度范围,甜苦杏仁多酚DPPH自由基清除率基本一致,在0～0.02 mg/mL浓度时,两者的DPPH自由基清除率均高于VC,但在0.02～0.024 mg/mL浓度时,出现了低于VC的情况。在0.024 mg/mL浓度时,甜苦杏仁多酚的DPPH自由基清除率分别为25.4%和23.7%。

ABTS自由基清除率的测定显示在0～0.024 mg/mL的较低浓度范围,甜杏仁多酚ABTS自由基清除率略高于苦杏仁多酚,且均高于VC。在0.024 mg/mL浓度时,甜苦杏仁多酚的ABTS自由基清除率分别为20.7%和19.3%。

2.2.2 杏仁皮多酚抗氧化能力差异性分析 杏仁皮多酚的抗氧化能力见图2。杏仁皮多酚的四个抗氧化能力指标均随着多酚浓度的增大而增高。还原力的测定表明,在0～0.24 mg/mL的浓度范围,甜苦杏仁多酚的还原力与甜苦杏仁皮多酚的还原力基本一致,且甜苦杏仁皮多酚的还原力低于VC。在0.24 mg/mL浓度时,甜苦杏仁皮多酚的还原力分别为0.859和0.882。

图2 杏仁皮多酚的抗氧化能力差异比较Fig.2 Different of antioxidant activity of kernel seedcase polyphenol

OH自由基清除率的测定表明,在0～0.24 mg/mL的浓度范围,甜杏仁皮多酚的OH自由基清除率高于苦杏仁皮多酚,两者均高于VC。在0.24 mg/mL浓度时,甜苦杏仁皮多酚的OH自由基清除率分别为74.5%和35.9%,甜杏仁皮多酚的OH自由基清除率约苦杏仁皮多酚的2倍。

DPPH自由基清除率的测定显示,在0～0.24 mg/mL的浓度范围,甜苦杏仁皮多酚DPPH自由基清除率基本一致,两者均低于VC。在0.24 mg/mL浓度时,甜苦杏仁皮多酚的DPPH自由基清除率分别为92.8%和92.5%。

ABTS自由基清除率的测定显示,在0～0.24 mg/mL的浓度范围,甜杏仁多酚皮ABTS自由基清除率基本一致,在0～0.20 mg/mL的浓度范围高于VC,在0.20～0.24 mg/mL的浓度时,与VC基本一致。在0.24 mg/mL浓度时,甜苦杏仁多酚的ABTS自由基清除率分别为99.5%和99.4%。

3 结论

超声是目前提取多酚最常用的方法之一[19-20]。杏仁和杏仁皮多酚超声提取优化条件表明,杏仁多酚超声提取条件为料液比1∶10、超声温度50 ℃、超声功率400 W,超声时间60 min。而杏仁皮多酚超声提取条件为料液比1∶10、超声温度60 ℃、超声功率400 W,超声时间60 min。两者差异仅存在超声温度上,料液比、超声功率和超声时间均一致。

抗氧化能力的测定由于反应特性和机制的差异,通常使用两种及两种以上方法[21]。本研究选取了还原力、OH、DPPH和ABTS自由基清除率四个指标进行分析。研究发现,杏仁多酚抗氧化能力差异较大。甜杏仁多酚的还原力、OH自由基清除率和ABTS自由基清除均高于苦杏仁多酚,均显示较低的水平。DPPH自由基清除率两者接近一致。甜苦杏仁皮多酚抗氧化能力差异不明显,两者在还原力、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率三者间基本一致,而OH自由基清除率,甜杏仁皮高于苦杏仁皮,约2倍左右,依次为74.5%和35.9%。本文的研究结果与王艳等[11]对杏仁油的多酚抗氧化能力的研究较为一致。总体来说,杏仁皮含有较为丰富的多酚,具有较强的抗氧化活性,实验不仅为杏仁皮的开发利用提供了参考,同时也表明杏仁皮是一种有前途的天然抗氧化剂新资源,值得进一步深入研究。

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Researchonultrasonicextractionoptimizationandantioxidantcapacitydifferenceofkernelandkernelseedcasepolyphenols

LIUMeng-pei,TIEShan-shan,ZHANGLi-hua,WANGXiao-yuan,TANGYin-hua,ZONGWei*

(School of Food and Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China)

In order to get the optimal solution to extract polyphenols from kernel and kernel seedcase,the ultrasonic apparatus was applied to treat sample,the independent variable were the ratio of raw material to water,ultrasonic temperature,ultrasonic power and time,the responses was content of kernel and kernel seedcase polyphenols. The orthogonal test analysis showed that the optimal ultrasonic conditions of kernel polyphenol determined were as: ratio of raw material to water 1∶ 10,ultrasonic temperature 50 ℃,ultrasonic power 400 W and ultrasonic time 60 min,and The optimal ultrasonic conditions of kernel seedcase polyphenol was ratio of raw material to water 1∶10,ultrasonic temperature 60 ℃,ultrasonic power 400 W and ultrasonic time 60 min. It also analyzed the antioxidant ability differences of kernel and kernel seedcase polyphenols using reducing power assay,OH,DPPH,ABTS radical-scavenging rate in order to provide a reference for the development of kernel polyphenol functional ingredients. The results showed that the antioxidant capacity of kernel polyphenol was positively related to polyphenol content. The sweet kernel polyphenol was higher than bitter kernel in reducing power assay and OH,ABTS radical-scavenging rate,and basically the same in DPPH radical-scavenging rate,25.4% and 23.7% in turn at 0.024 mg/mL of sweet and bitter kernel polyphenol. The antioxidant capacity of kernel seeacase polyphenol was not obvious,basically consistent in reducing power assay and DPPH,ABTS radical-scavenging rate in sweet and bitter kernel polyphenol. However,the sweet kernel seedcase polyphenol was two times than bitter kernel at 0.24 mg/mL in OH radical-scavenging rate. On the whole,the antioxidant capacity of sweet kernel polyphenol was better than the bitter kernel polyphenol,which had higher potential value.

kernel;kernel seedcase;polyphenol;antioxidant capacity

2017-05-02

刘梦培(1984-)，女，博士，讲师，研究方向：果蔬保鲜与加工利用，E-mail：mengpei0402@126.com。

*通讯作者:纵伟(1965-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬加工，E-mail：zongwei1965@126.com。

博士科研启动基金(2015BSJJ037)；河南省高等学校重点科研项目(17B550007)。

TS255.3

B

1002-0306(2017)23-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.030