生态调控技术对异育银鲫养殖池底泥菌群多样性的影响

苟小兰，苏艳秋,3，黄 丹，李骏程，吴立锋，罗国强

( 1．通威股份有限公司，四川 成都 610041； 2. 成都通威水产科技有限公司，四川 成都 610081； 3.四川大学 生命科学学院，四川 成都 610065 )

生态调控技术对异育银鲫养殖池底泥菌群多样性的影响

苟小兰1,2，苏艳秋1,2,3，黄 丹1,2，李骏程1,2，吴立锋1,2，罗国强1,2

( 1．通威股份有限公司，四川 成都 610041； 2. 成都通威水产科技有限公司，四川 成都 610081； 3.四川大学 生命科学学院，四川 成都 610065 )

为探讨菌藻调控技术、底质改良技术及投饵区微孔增氧技术对异育银鲫养殖池塘底泥微生物群落结构多样性的影响，在江苏大丰地区选择3口总面积约42.93 hm2的异育银鲫精养池塘实施以上技术，同时两口总面积约30 hm2的池塘作为对照池，采用PCR-DGGE方法比较分析4—7月池塘底泥中的细菌多样性。试验结果显示，试验塘底泥细菌多样性指数为3.15～3.52，明显高于对照塘的2.20～2.74，表明了三大技术的实施有利于提高底泥中细菌多样性指数，同时底泥菌群多样性指数的平均值与异育银鲫的损失率呈正相关，一定程度上反应了三大技术的联用有利于提高精养池塘生态稳定能力，间接增加养殖效益。

菌藻调控技术；底质改良技术；微孔增氧技术；异育银鲫；菌群多样性

自2012年春季，由鲤科疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpes virus Ⅱ，CyHV-2)引起的异育银鲫病毒性鳃出血病在江苏盐城地区爆发以来，已造成重大经济损失[1-2]。Wang等[3]分析了鲤鱼疱疹病毒Ⅱ型感染异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)的病例，发现其死亡率极高，部分池塘高达100%。由于是新发现的病毒性病害，目前尚未筛选出有效的治疗药物和疫苗[4]。有报道指出，防控这种病毒性疾病的出发点在于建设水产养殖环境的生态屏障，即通过底质改良、均衡增氧及菌藻调控等技术改善养殖环境、维持养殖环境生态稳定，减少或避免养殖鱼类的应激性刺激，然后再定时给予机体免疫增强剂，增强异育银鲫自身免疫力，使鱼体的免疫机能在与病毒搏击过程中处于优势地位[5]。

为减缓或控制异育银鲫鲤科疱疹病毒Ⅱ型病毒病的进一步扩大，通威股份有限公司在江苏异育银鲫主养区采取了一系列生态屏障建设工作，包括菌藻调控、底质改良、均衡增氧、底排污等生态调控技术，取得了良好效果。笔者采用PCR-DGGE比较分析江苏大丰市异育银鲫养殖生态屏障建设试验塘和对照塘底泥的微生物多样性，探讨生态调控技术对异育银鲫养殖池塘底泥细菌多样性的影响，为防控异育银鲫鲤科疱疹病毒Ⅱ型出血病提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验于2015年4—7月在江苏大丰斗龙港区异育银鲫精养池塘进行。选取5口土质鱼塘，池塘水面积约为30～43 hm2，水深1.6～1.7 m。将5口池塘随机分为试验组(3个)与对照组(2个)。试验组在养殖期间实施通威菌藻调控、底质改良及微孔增氧三大技术，对应产品分别为通威调水宝1号，通威活水宝1号、通威底改Ⅰ号及微孔增氧盘。试验组分别为A(面积14.67 hm2，放鱼量约为36.6万尾)、B(面积14.87 hm2，放鱼量约47.20万尾)、C(面积12.73 hm2，放鱼量约42.84万尾)；对照组按正常的养殖管理进行，分别为D(面积14.67 hm2，放鱼量约为37.85万尾)、E(面积15.33 hm2，放鱼量约为40.03万尾)。试验所用养殖动物均为健康的异育银鲫幼苗，体质量约50 g/尾，随机分配至各试验池塘中。

1.2 产品使用方法

1.2.1 通威光合菌的使用

通威光合菌(商品名通威调水宝1号)在池塘完成所有化学消毒处理3～4 d后使用，按照14.9～22.4 kg/(hm2·m)直接泼洒，水质较差时则按22.4～37.3 kg/(hm2·m)泼洒，每隔10～15 d使用1次，使用时注意观察水色及浮游动、植物生物量，最佳使用时间为晴天上午。

1.2.2 通威乳酸菌的使用

通威乳酸菌(商品名通威活水宝1号)在池塘完成所有化学消毒处理3～4 d后使用，将产品直接使用池塘水稀释100倍后按照14.9 kg/(hm2·m)直接泼洒全池，养殖中、后期酌情加大用量，每隔10～15 d使用一次，使用时注意观察水色及浮游动、植物生物量，最佳使用时间为10:00至16:00。当遇到养殖动物摄食不好，可按照20 mL/kg直接拌服饲料，以缓解养殖动物摄食不好的症状。

1.2.3 通威底改产品的使用

通威底改产品(商品名通威底改Ⅰ号)在下雨或倒藻前后使用，按照2985～3731 g/(hm2·m)均匀抛撒池底，当出现底质严重恶化如发黑、发臭、底热等现象可根据情况加量、连续或隔天使用。

1.2.4 通威微孔增氧的使用

在投饵区域安置微孔增氧设施，增氧盘按照养殖实际情况设置在直径约20～30 cm，在投料前0.5 h至投料后0.5 h开启，增加水体中溶解氧，缓解因鱼群聚集抢食造成的缺氧。

1.3 样品采集

底泥样品来源于江苏大丰县斗龙港，生态调控技术试验塘泥样编号为8#～18#，分别为试验组A、B、C池塘4—7月期间底泥样品；对照组泥样编号为1#～7#，分别为对照组D、E池塘4—7月底泥样品，每月固定于约20 d取样1次，取样位置为料台底部5 cm深处泥样，取3个不同的点泥样混合均匀，于-20 ℃保藏，并运送至成都通威科技水产有限公司微生物工程研究室。

1.4 样品总DNA提取

样本基因组提取称取约0.6 g样品，采用Soil DNA kit提取微生物总DNA。操作步骤参考试剂盒使用说明书。

1.5 变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析

采用细菌通用引物序列[6]:GC338f 和518r扩增16S rDNA V3区片段，具体PCR扩增程序参考Darawan等[7]方法进行。扩增结束取扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，将具有清晰条带的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分析。DGGE条件为：凝胶质量分数为8%，变性剂为40%～60%，60 ℃在1×TAE缓冲液中200 V、10 min，然后转100 V，12 h。采用荧光染料染色后，在凝胶成像仪中拍照，用BIO-RAD Quantity One软件对DGGE指纹图谱进行聚类分析，通过Biodap软件对样品泳道灰度值进行分析，计算不同样品微生物多样性指数。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

以提取的底泥微生物总DNA为模板进行PCR扩增，产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，扩增出16S rDNA的V3区片段(图1)，从扩增检测结果，目的片段约240 bp，扩增特异性很好。

图1 16S rDNA V3区片段PCR扩增图谱

2.2 池塘底泥微生物群落结构分析

2.2.1 菌群DGGE图谱分析

江苏大丰地区异育银鲫精养试验组与对照组池塘底泥细菌群落多样性的DGGE图谱见图2和图3。比较DGGE各条带相对光密度发现，对照组底泥样品共产生了27条可鉴别的条带，而试验组池塘泥样产生了多达52条可鉴别的条带。由图2、3及表1可知，在4—7月份养殖周期中，试验组底泥电泳条带数为25～36，而对照组电泳条带数为14～18，与对照组相比，试验组底泥样品中的电泳条带数明显较多。同时，对照组底泥样品图谱条带数在不同月份平均得到条带数为12～18，而试验组图谱条带数在不同月份平均得到条带数为27～34，显著高于对照组，表明了三大技术的实施有利于提高精养池塘底泥微生物区系的多样性。此外，通过DGGE分离图谱显示，各异育银鲫精养池塘随养殖时间增加，底泥微生物群落呈现递减趋势。

图2 对照组D、E池塘底泥中细菌DGGE图谱及模式图

1，1#；2，2#；3，3#；4，4#；5，5#；6，6#；7，7#；1#～4#，4—7月对照组D底泥样品；5#～7#，5—7月对照组E底泥样品.

图3 生态调控技术试验组底泥细菌DGGE图谱及模式图

1，8#；2，9#；3，10#；4，11#；5，12#；6，13#；7，14#；8，15#；9，16#；10，17#；11，18#；8#～11#，4—7月试验组A池塘底泥样品；12#～15#，4—7月试验组B池塘底泥样品，16#～18#为5—7月试验组C池塘底泥样品.

2.2.2 菌群Shannon指数分析

在实施三大技术的异育银鲫精养池塘整个试验周期内(4—7月份)底泥样品微生物群落Shannon指数平均为3.35，而对照组底泥样品微生物群落Shannon指数平均为2.46。在各个月份底泥样品中，试验组(A、B、C)Shannon指数均值分别为3.29、3.43、3.33，而对照组(D、E)Shannon指数均值分别为2.57、2.28(表1)。总体趋势是试验组微生物群落多样性高于对照组，其中试验组B多样性最高，对照组E最低，表明了菌藻调控技术、底质改良技术及微孔增氧技术的利用有利于提高异育银鲫养殖池塘底泥中微生物群落的多样性。

表1 试验组与对照组DGGE图谱条带及细菌多样性指数

注：H′为Shannon指数.

2.3 异育银鲫死亡率分析

本研究统计了试验期间(4—7月)各组异育银鲫的死亡率，以探究精养池塘底泥微生物群落结构丰度差异对养殖效果的影响(表2)。A、B、C 3组底泥微生物群落区系多样化的池塘，异育银鲫死亡率分别为5.65%、1.26%、3.90%，而D、E菌群多样性丰度较低的对照组鱼体死亡率分别达到了33.38%、12.20%，明显高于试验组。此外，从重大疾病的发生情况分析，底泥菌群丰富的池塘在养殖周期中未爆发重大疾病，而对照组池塘观察到了鲤科疱疹病毒Ⅱ型鳃出血疾病及细菌性出血病。

表2 养殖期间试验组及对照组异育银鲫死亡情况

3 讨 论

“养鱼先养水，养水先养泥”，在水生生态系统中，池塘底泥是最活跃与最具影响力的组成成分之一，与养殖动物、养殖水环境间关系密切[8]。底泥不仅承担水体丰富营养物质的提供、环境剧烈变化的缓冲等作用，同时还提供种类繁多的益生菌和底栖生物活动、栖息场所，与养殖动物生长息息相关[9-10]。

李越蜀等[11-12]研究发现，底泥中丰富的微生物是池塘自净能力的主要组成部分，对养殖过程中的物质循环和资源再利用起着关键作用，尤其在选择大量投饵的精养模式下，注重底泥微生物群落结构多样性的搭建，有利于营养与能量的充分利用，减少相关病害的发生。本研究通过DGGE 图谱中条带数目变化可知，异育银鲫精养池塘底泥中实施了菌藻调控、均衡增氧等生态调控技术的试验组细菌丰度在整个试验期间与对照组相比差异较大，表现出试验组细菌丰度整体高于对照组。结合最终养殖结果发现，底泥微生物群落多样性高的异育银鲫精养池塘，其发生鲤科疱疹病毒Ⅱ型疾病的概率显著低于菌群多样性低的池塘，因此可将丰富池塘底泥细菌多样性作为防控异育银鲫鲤科疱疹病毒Ⅱ型出血病的一项重要工作。此外，本研究发现了精养池塘底泥微生物群落随养殖进程的推移，其细菌多样性减少，目前尚未有相关文献报告该现象，推测原因可能为：(1)在养殖后期投饵量增加，层积在底部的残饵、粪便及动物尸体等有机物超出了自净能力，一方面阻碍了营养物质向微生物群落输入，另一方面有害物质增加，抑制了微生物的生长；(2)随着饲料持续性加入，可能在一定程度上对菌群进行了定向性驯化，从而导致了菌群多样性的衰减。针对菌群多样性减少的机理方面仍需要大量研究证实。

虽然目前利用DGGE技术对异育银鲫养殖池塘底泥微生物群落多样性有了初步认识，但底泥环境中微生物组成较为复杂，尚未对微生物群落组成进行测序分析，在后期研究工作中，将会基于现阶段的研究成果，针对性地利用高通量测序技术分析底泥中的微生物群落组成及其代谢途径，为鲤科疱疹病毒Ⅱ型疾病的防控提供更具体的理论与技术支撑。

4 结 论

(1)菌藻调控技术、底质改良技术及微孔增氧技术的实施有利于提高异育银鲫精养池塘底泥微生物群落结构多样性。

(2)精养池塘底泥丰富的微生物区系有助于减少或延缓异育银鲫的发病或死亡，直接增加养殖收益。

(3)建立异育银鲫养殖过程中池塘底泥微生物群落多样性的监测，对鳃出血或细菌性疾病的爆发具有一定程度上的预警功能。

[1] 刘文枝,曾令兵,张辉，等. 异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)后血液生理生化指标变化的研究[J]. 上海海洋大学学报,2013,22(6):928-933.

[2] Xu J, Zeng L, Zhang H, et al. Cyprinid herpesvirus 2 infection emerged in cultured gibel carp,Carassiusauratusgibelioin China[J]. Veterinary Microbiology, 2013, 166(1):138-144.

[3] Wang L, He J, Liang L, et al. Mass mortality caused by Cyprinid Herpesvirus 2 (CyHV-2) in Prussian carp (Carassiusgibelio) in China[J]. Bull Eur Assoc Fish Pathol, 2012, 32(5):164-173.

[4] He J, Shi X, Yu L, et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis of Cyprinid herpesvirus 2[J]. Journal of Virological Methods, 2013, 194(1):206-210.

[5] 陈昌福,陈辉,胡明，等. 异育银鲫疱疹病毒病及其防控对策(下)[J]. 当代水产,2015(5):77-79.

[6] Svanevik C S, Lunestad B T. Characterisation of the microbiota of Atlantic mackerel (Scomberscombrus) [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 151(2):164-170.

[7] Ruamkuson D, Tongpim S, Ketudat-Cairns M. A model to develop biological probes from microflora to assure traceability of tilapia[J]. Food Control, 2011, 22(11):1742-1747.

[8] 林文辉, 黄志斌, 林明辉, 等. 饲料、底泥、水质与水产病害防控关系研究[J]. 广东饲料, 2014, 23(8):48-52.

[9] 林文辉, 王亚军, 陈总会, 等. 池塘底质及其修复与管理(上)[J]. 科学养鱼, 2015(6):29-30.

[10] 林文辉, 王亚军, 陈总会, 等. 池塘底质及其修复与管理(下)[J]. 科学养鱼, 2015(7):23-24.

[11] 李越蜀.南美白对虾生态综合养殖池塘底泥细菌群落结构及功能多样性研究[D]. 宁波:宁波大学：2014.

[12] 李晓, 李冰, 朱健, 等. 精养团头鲂池塘沉积物微生物群落的结构特征及组成多样性分析[J]. 水产学报, 2014, 38(2):218-227.

EffectofEcologicalRegulationTechniquesonMicrobialDiversityinSedimentsinAllogyogeneticSilverCrucianCarpCarassiusauratusgibelioCulturePonds

GOU Xiaolan1,2，SU Yanqiu1,2,3，HUANG Dan1,2， LI Juncheng1,2，WU Lifeng1,2， LUO Guoqiang1,2

( 1.Tongwei Group Co.， Ltd.，Chengdu 610041，China; 2.Chengdu Tongwei Aquatic Science and Technology Co., Ltd.，Chengdu 610081，China; 3.College of Life Science,Sichuan University，Chengdu 610065, China )

The effects of synergistic bacteria and algae regulation, sediment improvement and balance aeration on water quality factors and microbial diversity in sediments in allogyogenetic silver crucian carpCarassiusauratusgibelioculture ponds were studied in three allogyogenetic silver crucian carp culture ponds (a total area of about 42.93 hm2), and the other two ponds(a total area of about 30.00 hm2) without the methods mentioned above as the control in Dafeng county in Jiangsu province. The PCR-DGGE method was used to analyse the bacterial diversity in sediments in the ponds from April to July. The results showed that there was significantly higher bacterial diversity index (3.15-3.52) in the experimental pond sediments than that in the control pond sediments (2.20-2.74), indicating that the three technicals were helpful to improve the microbial diversity index. Meanwhile, average bacterial diversity index in experimental pond sediments were positively correlated with the fish-loss. That is, the better work was, the higher microbial diversity index in sediment was. To some degree, it infers that the linkage of the three technologies will help improve intensive pond ecological stability and increase feeding efficiency.

synergistic bacteria and algae regulation; sediment improvement ; balance aeration ;Carassiusauratusgibelio; bacterial diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.005

2015-12-24；

2016-05-23.

“十二五”农村领域国家科技支撑计划项目(2015BAD13B03).

苟小兰(1987—)，女，硕士研究生；研究方向：水产益生菌应用.E-mail：394391796@qq.com.通讯作者：苏艳秋(1984—)，女，博士研究生；研究方向：资源微生物. E-mail：745564373@qq.com.

S917.1

A

1003-1111(2017)02-0148-05