不同施肥条件对土池培育小球藻总脂含量及脂肪酸组成的影响

2017-12-18梁明明白永安李晓东

水产科学 2017年2期

陈炜，梁明明，白永安，李晓东，赵文

( 1.大连海洋大学辽宁省水生生物学重点实验室，辽宁大连 116023； 2.大连海洋大学水产与生命学院, 辽宁大连 116023； 3.盘锦光合蟹业有限公司，辽宁盘锦 124200 )

陈炜1,2，梁明明2，白永安3，李晓东3，赵文1,2

以辽宁盘锦光合蟹业有限公司养殖基地为试验场所，研究施以3种肥料(化肥、鸡肥、化肥与鸡肥的混和肥)对土池培育小球藻的主要营养指标——脂质含量和脂肪酸组成的影响。试验结果表明，施混合肥所培养的小球藻，其藻细胞密度略高于化肥组和鸡肥组；混合肥组小球藻的脂质含量(鲜质量的5.36%)也高于化肥组(鲜质量的4.02%)和鸡肥组(鲜质量的2.89%)；混合肥组小球藻的多不饱和脂肪酸和高度不饱和脂肪酸的含量显著优于单一施化肥或鸡肥的小球藻。因此，在土池中施混合肥更有利于培育出高质量的小球藻。

小球藻；脂质；脂肪酸；施肥；土池

小球藻(Chlorella)是仔鱼、虾、蟹、贝类幼体重要的生物饵料，也是培养轮虫等浮游动物的饵料[1-2]。小球藻的脂肪酸组成和含量是评价其营养价值的重要指标之一，其中的多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，是海产动物的必需脂肪酸，对其存活和幼体生长至关重要[3-4]。大量研究表明，培养条件与小球藻的脂肪酸组成和含量密切相关[5-8]，关于营养条件和营养方式影响小球藻脂质和脂肪酸的研究多集中于室内培养[9-11]。生产上常采用室外土池培养生物饵料，与室内培养条件相比，室外土池的影响因素更复杂，积累的数据资料相对较少。在土池培养生物饵料方面，先后有学者就土池培养轮虫、桡足类、卤虫(Artemia)、糠虾的脂肪酸营养[12-14]以及施肥后土池中浮游生物种群变动状况[15-16]等进行了研究，笔者亦先后研究了季节及生长周期对土池小球藻脂肪含量和脂肪酸组成的影响[17-18]，尚未见到有关施肥对土池培育小球藻脂肪酸营养方面的报道。

本文对比研究了施以化肥、鸡肥、化肥与鸡肥的混和肥(简称混合肥)对小球藻脂质含量和脂肪酸组成的影响，为室外土池大规模、高质量的培养小球藻提供依据。

1 材料与方法

1.1 小球藻的培养和采集

试验在辽宁盘锦光合蟹业有限公司三角洲养殖场基地进行。试验材料为蛋白核小球藻(C.pyrenoidesa)。试验池为户外土池，规格15 m×5 m，水深0.4 m。用100 mg/L的漂白粉处理土池。第2 d按1∶1比例接种，然后1号池施化肥(碳酸氢铵100 mg/L、过磷酸钙30 mg/L)，2号池施鸡粪肥(与1号池所施化肥量相当)，3号池施混合肥(鸡粪肥∶化肥=1∶1)，全池均匀泼洒。

试验期间每日测定藻细胞密度和水化指标，每隔2～3 d追加施肥并补充因蒸发而减少的水量。培养期间主要水质指标为：水温25.7～29.1 ℃，盐度21～23，pH 8.01～9.85，溶解氧6.5～20.0 mg/L，氨氮24.29～70.95 mg/L，活性磷0.71～2.37 mg/L。

在藻细胞密度达到稳定时取样，连续采集2个周期。经高速离心(16 000 r/min)后，得到不同施肥条件下的小球藻藻膏，于-24 ℃下保存待测。

1.2 脂质提取、脂肪酸测定方法

脂质的提取采用改进的Folch法[19]。将所得脂质用KOH-甲醇在70 ℃水解1 h ，再用BF3催化法[20]制备脂肪酸甲酯。最后萃取到石油醚中，浓缩，待上机分析。

用GC-2010型气相色谱仪(日本岛津公司)进行脂肪酸测定。色谱条件：分析柱为FFAP抗氧化交联石英毛细管柱(购自中国科学院大连化学物理研究所，规格为30 m×0.25 mm×0.3 μm)；载气为高纯N2，柱流量1 mL/min，分流比100∶1；柱温由160 ℃以2 ℃/min的速度升至230 ℃，并保持至出峰完毕；进样口温度250 ℃；FID检测器温度230 ℃。色谱峰的鉴定采用脂肪酸甲酯标准样品(SIGMA公司)与ECL文献值相结合的方法[21-23]，定量采用面积归一化法。

1.3 数据处理方法

平行测定3个样品。试验数据用平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和多重比较，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同施肥条件下小球藻的生长情况

不同施肥条件下连续2个周期的藻细胞密度变化曲线见图1。由图1可见，接种后1～2 d藻细胞数缓缓增加，接种后2～4 d细胞数明显增加，随后的2～3 d藻细胞密度稳定在1.0×107个/mL。此时，抽出部分藻液收获加工，然后补水追肥，藻细胞数迅速减少，在原池中继续培养小球藻，藻细胞密度进入第2个变化周期。结果显示，不同施肥组藻细胞密度变化曲线具有一致性，混合肥组平稳期的藻细胞数量略高于化肥组和鸡肥组。

图1 不同施肥条件下小球藻的藻细胞密度变化曲线

2.2 不同施肥条件下小球藻脂质含量

不同施肥条件下小球藻脂质含量见表1。由表1可知，施加混合肥培育的小球藻脂质含量最高，化肥组次之，鸡肥组最低。混合肥组小球藻的脂质含量显著高于鸡肥组。

表1 不同施肥条件下小球藻脂质含量(鲜质量) %

注：同一行标有不同字母的组间差异显著(P<0.05).下同.

2.3 不同施肥条件下小球藻脂肪酸的组成和含量

不同施肥条件下小球藻主要脂肪酸组成和含量见表2。

表2 不同施肥条件下的小球藻主要脂肪酸含量 %

由表2可知，不同施肥组的主要脂肪酸种类相同，均为11种；含量最高的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸分别为16:0、16:1和20:5n-3。但不同施肥组之间部分脂肪酸含量存在一定差别。混合肥组的多不饱和脂肪酸含量和高度不饱和脂肪酸含量(24.39%、22.67%)显著高于化肥组(22.72%、21.17%)和鸡肥组(21.28%、19.13%)，而单不饱和脂肪酸含量(25.76%)明显低于化肥组(26.17%)和鸡肥组(26.64%)，各试验组之间的饱和脂肪酸含量差异不显著。

3 讨论

利用土池培养的生物饵料脂类营养方面研究已有一些进展。吴旭干等[12]的研究表明，土池培育的褶皱臂尾轮虫(Brachionusplicatilis)的二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸、高度不饱和脂肪酸含量均显著高于酵母和微绿球藻(Nannochloropsis)培育的轮虫，具有明显的营养优势；朱迪琴[13]等利用土池培育了卤虫、轮虫、桡足类、糠虾等生物饵料，并分析了其脂类营养特点；陈炜等[14]比较了泼洒鸡粪浆培育的褶皱臂尾轮虫与5种单一微藻培育的轮虫的脂肪酸营养，结果表明鸡粪浆轮虫的高度不饱和脂肪酸含量高于微绿球藻轮虫和衣藻(Chlamydomonas)轮虫，与球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)轮虫和新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)轮虫接近，但明显低于小球藻轮虫。

本试验结果表明，施混合肥的土池小球藻不仅在平稳期藻细胞数略高于鸡肥组和化肥组，而且脂质和多不饱和脂肪酸、高度不饱和脂肪酸含量也显著高于其他两组。混合肥组、化肥组和鸡肥组的多不饱和脂肪酸分别占小球藻鲜质量的1.30%、0.9%、0.6%(其中二十碳五烯酸分别占小球藻鲜质量的1.0%、0.7%、0.5%)。说明施混合肥有利于土池培育高营养价值的小球藻。笔者曾多次测定该地区土池培育小球藻的脂肪酸组成和含量，此次测定结果中多不饱和脂肪酸、高度多不饱和脂肪酸、二十碳五烯酸的含量相对较低，主要原因是本次取样时间为夏季，而季节对土池小球藻脂肪酸含量的影响非常明显[17]。

氮、磷、碳等主要营养元素及其比例均与微藻的生长和营养富集相关[5-7，9]。根据中国有机肥料养分志的数据，鸡粪烘干基含有机碳30.146%，全氮2.338%，全磷0.929%，全钾1.606%；鸡粪鲜基含有机碳16.511%，全氮1.032%，全磷0.413%，全钾0.717%[24]。鸡粪中碳、氮、磷含量不是很充足，不能完全满足小球藻对营养盐的需求。本试验所用的化肥是碳酸氢铵和过磷酸钙，化肥中氮、磷、碳含量虽然充足，但是化肥遇水易分解，营养盐补充迅速，但损耗相对也快，营养盐不能被小球藻充分利用，最佳繁殖条件难以维持。鸡粪和化肥混合使用，恰好互补了两者的不足。相比室内可控条件，土池培养小球藻虽然条件粗放，影响因素较多，但更接近于自然，收获量大，成本低，更适合于大规模生产。

水体富营养化问题是整个水产养殖业面临的共性问题。在生产过程中，土池水体实际上一直处于富营养化状态，以保证小球藻的持续稳定高产。盘锦地区的生产季节通常自3月初到10月末，建议在停止生产前期，抽取藻液后，只补水不再追加施肥，让小球藻自然消耗掉土池中的营养盐，并随着藻液的抽出而带出水体。采取这一措施虽然生产末期小球藻的收获周期增长，收获量降低，但有利于保护水体生态环境，也有益于当地生产的可持续发展。

致谢

试验期间得到大连海洋大学雷衍之教授和李永函教授的指导和帮助，在此表示衷心感谢！

[1] 王金秋,李德尚,曹吉祥.5种藻和2种酵母对萼花臂尾轮虫饵料效果的比较研究[J].水生生物学报,2003,27(5):476-486.

[2] 黄显清,王武,成永旭.不同喂养条件和营养强化对大型溞总脂及脂肪酸组成的影响[J].上海水产大学学报,2001,10(1):49-54.

[3] 荻野珍吉著. 陈国铭，黄小秋译. 鱼类的营养和饲料[M].北京：海洋出版社，1987：126-148.

[4] 陈立侨,江洪波,周忠良,等.ω-3HUFA对中华绒螯蟹幼体存活率及体脂肪酸组成的影响[J].水产学报,2000,24(5):448-452.

[5] 石娟,潘克厚.不同培养条件对微藻总脂含量和脂肪酸组成的影响[J].海洋水产研究,2004,25(6):79-85.

[6] 杨秀霞,于浩,曾晓起.影响微藻脂肪酸组成因素概述[J].海洋湖沼通报,2001(1):76-82.

[7] 丁彦聪,高群,刘家尧,等.环境因子对小球藻生长的影响及高产油培养条件的优化[J].生态学报,2011,31(18):5307-5315.

[8] Teoh M L, Chu W L, Marchant H, et al. Influence of culture temperature on the growth, biochemical composition and fatty acid profiles of six Antarctic microalgae [J]. Journal of Applied Phycology,2004(16):421-430.

[9] 曹春晖,孙世春,麦康森,等.氮浓度对四株海洋绿藻总脂含量和脂肪酸组成的影响[J].海洋湖沼通报,2006(3):79-84.

[10] 严佳琦,黄旭雄,黄征征,等.营养方式对小球藻生长性能及营养价值的影响[J].渔业科学进展,2011,32(4):77-84.

[11] 胡慧慧,徐年军.不同培养基及组成对2种小球藻生长和油脂的影响[J].生物学杂志,2012,29(4):12-16.

[12] 吴旭干,成永旭,贺诗水,等.褶皱臂尾轮虫土池低盐度培育及其脂肪酸营养评价[J].海洋水产研究,2007,28(4):59-65.

[13] 朱地琴,吴旭干,潘迎捷,等.土池肥水培育的生物饵料与卤虫无节幼体的脂类及脂肪酸组成的比较研究[J].上海水产大学学报,2007,16(5):448-453.

[14] 陈炜,李晓东,王增立,等.鸡粪浆及5种微藻对轮虫脂肪酸组成的影响[J].水产科学,2006,25(3):113-116.

[15] 王海雷,赵文,李晓东,等.施肥对多盐水池塘浮游植物演替的影响[J].中国水产科学,2005,12(5):608-613.

[16] 白国福,张广英,窦亚秋,等.施肥后河蟹育苗试验围隔浮游生物状况及其变动[J].水产科学,2006,25(12):644-648.

[17] 陈炜,白永安,李晓东,等.春夏季辽宁盘锦地区土池培养的小球藻总脂含量和脂肪酸组成的分析[J].大连海洋大学学报,2013,28(6):585-588.

[18] 陈炜,梁明明,白永安,等.小球藻不同生长时期总脂含量和脂肪酸组成的变化[J].水产科学,2013,32(9):545-548.

[19] Christie W W. Lipid Analysis[M]. Oxford:Pergamon Press, 1982:22.

[20] Metcalfe L D, Schmitz A A, Peaka J R, et al. Rapid preparation of fatty acids esters from lipids for gas chromatographic analysis[J]. Analyt Chem,1966,38(3):514-515.

[21] Ackman R G. Analysis of oils and fats[M]. London: Elsevies Appl Sci Pub,1986:137-206.

[22] Ackman R G. Simplification of analyses of fatty acids in fish lipids and related lipid samples[J]. Acta Med Scand,1987,222(2):99-103.

[23] Christie W W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas chromatography:a reappraisal[J]. J Chromat,1988(447):305-314.

[24] 全国农业技术推广服务中心.中国有机肥料养分志[M].北京:中国农业出版社,1999:19-21.

EffectsofDifferentFertilizedConditiononLipidContentandFattyacidCompositioninGreenAlgaChlorellainanEarthenPond

CHEN Wei1,2, LIANG Mingming2,BAI Yongan3, LI Xiaodong3,ZHAO Wen1,2

( 1. Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province，Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China;3. Panjin Guanghe Crab Industry Co. Ltd., Panjin 124200, China )

The total lipid content and the fatty acid composition were determined in green algaChlorellapyrenoidesacultured in the outdoor ponds with different manure conditions (fertilizer, chicken dung, mixed-use of chicken dung and fertilizer) in Panjin Guanghe Crab Industry Co. Ltd. The results showed that there was slightly higher density of alga sampled from the mixed-use of chicken dung and fertilizer ponds than that sampled from the chicken dung pond or fertilizer ponds. The total lipid content ofC.pyrenoidesacultivated by the mixed-use of chicken dung and fertilizer (5.36% of fresh weight) was significantly higher than that inC.pyrenoidesacultivated by a single kind of fertilizer (4.02% of fresh weight)or chicken dung(2.89% of fresh weight).The percentage of polyunsaturated fatty acid (PUFA), highly unsaturated fatty acid (HUFA) ofC.pyrenoidesagathered from the mixed-use of chicken dung and fertilizer pond were significantly higher than that inC.pyrenoidesagathered from the other two kinds of ponds. Therefore, mixed-use of chicken dung and fertilizer was the most conducive to produce high quality in outdoor ponds.

Chlorellapyrenoidesa; lipid;fatty acid; applied fertilizer; pond

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.012

2016-05-11；

2016-07-28.

国家海洋局海洋公益项目(201305005-02)；盘锦光合蟹业有限公司委托大连海洋大学科研项目(2012023).

陈炜(1968-)，女，高级实验师；研究方向：水产营养与饲料分析.E-mail:chenwei@dlou.edu.cn.

S963.16

1003-1111(2017)02-0188-04