应用拮抗试验分析灵芝菌株遗传多样性

李倩芸 李荔清 张维瑞 刘盛荣



应用拮抗试验分析灵芝菌株遗传多样性

李倩芸 李荔清 张维瑞 刘盛荣

（宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100）

收集25株赤芝及5个灵芝属的非赤芝菌株作为供试菌株，采用拮抗试验分析灵芝（赤芝）菌种的遗传多样性。结果：25株赤芝全随机300个配对中291个配对产生拮抗反应，占97.00%。其中151对形成拮抗线，占50.33%；98对形成隆起拮抗反应，占32.67%；42对形成沟状反应，占14.00%；有9个配对无拮抗反应，占3.00%。另还发现4株赤芝与其他非赤芝菌株未形成拮抗反应。表明我国灵芝（赤芝）菌株具有丰富的遗传多样性。

灵芝；拮抗试验；遗传多样性；种质资源

灵芝（），又称为赤芝、仙草、瑞芝，是我国一种著名的珍贵中药材，已有2 000多年的药用历史。灵芝含有丰富的生物活性成分，如蛋白质、多肽、核苷、多糖、甾醇、氨基酸、三萜等。其中，灵芝多糖和三萜为灵芝主要关键活性成分，具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化等作用[1]。常用于治疗肝炎、高血压、糖尿病和胃癌等疾病；经常食用灵芝可延年益寿、增强体质。近年来灵芝市场需求不断增长，发展潜力巨大。

灵芝在我国主要采用代料和短段木等方式栽培生产，收获木质化子实体及其弹射的担孢子。近年来，由于市场需求增长，栽培规模不断扩大，随之而来的灵芝属命名混乱，同名异种、同种异名现象越来越突出。因此有必要对我国灵芝菌种进行遗传多样性分析。拮抗试验因具有快速、便捷等优点，在真菌分类学上被广泛地应用[2]。本研究从不同科研单位收集25个赤芝菌株和5个灵芝属而非赤芝菌株（表1）作为供试对象，采用拮抗试验法，分析灵芝菌株的遗传多样性，以期为灵芝育种和栽培提供参考。

表1 供试菌株的一般信息

1 材料与方法

1.1 菌株信息

供试30个菌株的一般信息见表1，其中25株为赤芝，另5株（NA2、NA23、NA29、NA30、NA43）为灵芝属非赤芝菌株。

1.2 培养基

菌株活化及拮抗实验采用PDA培养基，其配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，自来水1 000 mL。

1.3 方法

（1）菌株活化。将保藏的供试斜面母种从4 ℃菌种保藏箱取出，1天后于超净工作台转管至新鲜PDA斜面，25 ℃活化培养7天。

（2）拮抗配对及培养。超净工作台中将熔化的PDA培养基15～20 mL倒至9 cm培养皿，凝固后，将活化的约黄豆粒大小菌种接种至培养基表面近中间位置，同时在相距约1 cm处接种另一菌株。在25 ℃下培养至两菌落交汇后，观察菌丝间的拮抗反应。

表2 不同菌株拮抗现象数量统计

2 结果与分析

2.1 菌株拮抗反应

图1为灵芝菌株3种典型的拮抗反应图例，菌落间形成菌丝隆起（a），拮抗线（b），沟状（c），及少数配对菌丝间的无拮抗反应（d）。无拮抗反应的两菌株可能为同种异名菌株或具有很近的亲缘关系。

注：a 隆起；b线状；c 沟状；d无拮抗反应。

2.2 菌株不同拮抗反应的数量统计

供试的30株菌株拮抗反应结果如表2所示。从中可以看出，在25个赤芝菌株随机300个配对中，有291个配对产生拮抗反应，占97.00%。其中151对形成拮抗线，占50.33%，98对形成隆起，占32.67%，42对形成沟状反应，占14.00%。9个配对无拮抗反应，占3.00%，分别为：①NA8︰NA16；②NA11︰NA21；③NA11︰NA32；④NA16︰NA32；⑤NA21︰NA32；⑥NA32︰NA39；⑦NA35︰NA38；⑧NA39︰NA49；⑨NA44︰NA49。可能两者亲缘关系很近或者是同种异名菌株。值得注意的是，菌株NA32与NA11、NA16、NA21和NA39均无拮抗反应；菌株NA11与NA21也未产生拮抗反应，NA11、NA21和NA32可能为同种异名菌株。

从表2还可以看出，4个赤芝菌株（NA8、NA13、NA22以及NA37）与非赤芝菌株配对未形成拮抗反应，其中包括NA2︰NA22；NA2︰NA37；NA8︰NA43；NA13︰NA30。由此可知，拮抗反应不适宜用来分析具有明显不同遗传背景菌株的亲缘关系。

3 讨 论

高等担子菌在双核菌丝阶段发生的认识自我和排斥异己的过程称为体细胞的非亲和性。遗传背景明显不同的个体在交界区会形成明显的分界线，即为拮抗反应。拮抗试验在辅助鉴定分析亲缘关系中得到普遍应用，如秀珍菇[3]、杏鲍菇[4]、真姬菇[5]、香菇[6]等菌种的鉴定及亲缘关系分析。但该方法也存在一定的局限性[7]。

随着分子生物学技术的快速发展及其所显示出的更高菌株鉴别能力，于是分子标记技术开始与拮抗试验同时用于菌株鉴定及亲缘关系分析等，以提高结果准确性。王锦锋等[8]利用ITS序列分析、RAPD分子标记技术对灵芝属菌株进行分类，结果与拮抗实验一致。唐传红等[7]采用RAPD技术和拮抗试验对灵芝属菌株进行分类，所得结果一致。

本研究收集的25个赤芝菌株随机300个配对中，有291个配对（为97.00%）形成拮抗反应，主要形成沟状、线状以及隆起3种不同的拮抗现象。从中显示出我国灵芝（赤芝）菌种具有丰富的遗传多样性。Sun等[9]利用SRAP分子标记技术分析灵芝属菌株的遗传多样性；Zheng等[10]采用AFLP分子标记及ITS测序分析灵芝属菌株遗传多样性。结果两者均显示赤芝及灵芝属菌株的遗传多样性，与本研究结果非常相近。此结果对灵芝育种及栽培具有一定的参考价值。

[1] 刘高强, 赵艳, 王晓玲, 等. 灵芝多糖的生物合成和发酵调控[J]. 菌物学报, 2011, 30(2): 198-205.

[2] 唐传红, 苏春丽, 张劲松, 等. 灵芝属分类学研究进展[J]. 食用菌学报, 2007, 14(3): 86-90.

[3] 李维焕, 蔡德华, 郑芳, 等. 秀珍菇菌株的亲缘关系分析[J]. 食品科学, 2010, 31(17): 267-271.

[4] 刘盛荣, 张维瑞, 柯斌榕, 等. 基于拮抗试验的杏鲍菇菌株分类研究[J]. 食药用菌, 2015, 23(1): 33-36.

[5] 刘蕾, 宁丽, 郭立忠, 等. 12个真姬菇菌株拮抗试验及部分同工酶分析[J]. 食用菌, 2008, 26(1): 12-14.

[6] 贾定洪, 王波, 郑林用, 等. 应用拮抗及ISSR方法鉴定袋料香菇菌株[J]. 西南农业学报, 2013, 26(2): 832-834.

[7] 唐传红, 张劲松, 陈明杰, 等. 利用拮抗实验和RAPD对灵芝属菌株进行分类研究[J]. 微生物学通报, 2005, 32(5): 72-76.

[8] 王锦锋, 李晶, I. L. Datti, 等. 利用拮抗、ITS和RAPD技术对灵芝属菌株分类的研究[J]. 西南农业学报, 2017, 30(1): 26-33.

[9] Sun SJ, Gao W, Lin SQ, et al. Analysis of genetic diversity inpopulation with a novel molecular marker SRAP[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72: 537-543.

[10] Zheng LY, Jia DH, Fei XF, et al. An assessment of the genetic diversity withinstrains with AFLP and ITS PCR-RFLP[J]. Microbiological Research, 2009, 164: 312-321.

Analysis of the genetic diversity ofstrains based on antagonism

Li Qianyun Li Liqing Zhang Weirui Liu Shengrong

（College of Life Science, Ningde Normal University, Ningde Fujian 352100）

A total of 30strains (25 strains belonging to.) were used for antagonism test to analyze the genetic diversity ofstrains in China. The results demonstrated that, out of 300 pairings among 25.strains, 291 formed antagonism reaction with the ratio of 97.00% (151 pairings produced line at 50.33% ratio, 98 pairings were bulge at 32.67%, 42 pairings were barrage at the ratio of 14.00%). The remaining 9 pairings at 3.00% did not show antagonism. In addition, no antagonism was observed for 4 pairing between.strains and otherstrains. These findings proved that there is an abundant genetic diversity within.strains in China.

; antagonism; genetic diversity; germplasm

S567.3+1

A

2095-0934（2017）06-363-03

福建省教育厅项目（编号JA15563）；宁德师范学院服务海西项目（编号2013F22）

通讯作者：刘盛荣，男，副教授，主要从事食用菌育种及药用菌发酵研究，E-mail：fjhost@163.com