应用Sysmex XT-4000i体液模式进行脑脊液细胞计数的性能评价*

耿丽丽 刘义庆 王泽筠 沈亚娟 亓琳 赵万辉 张炳昌

·仪器评价·

应用Sysmex XT-4000i体液模式进行脑脊液细胞计数的性能评价*

耿丽丽 刘义庆 王泽筠 沈亚娟 亓琳 赵万辉 张炳昌

目的 评估血细胞分析仪Sysmex XT-4000i体液（body fluid，BF）模式进行脑脊液细胞计数的性能。 方法收集2015年6～12月山东省立医院住院患者脑脊液标本142份，用XT-4000i进行细胞计数和分类，并与人工显微镜（人工灌板和细胞离心染色）计数进行方法学比较。结果 XT-4000i和人工显微镜计数之间白细胞计数（y=1.17x+3.21，n=118，r2=0.98）、单个核细胞计数（y=0.81x+13.61，n=101，r2=0.88）、多个核细胞计数（y=0.82x+5.15，n=101，r2=0.88）、红细胞计数（y=1.01x+146.40，n=62，r2=0.99）均呈高度相关。XT-4000i检测的研究参数高荧光强度细胞（HF-BF）水平与显微镜下查到大细胞（吞噬细胞或恶性细胞等）具有相关性（y=0.54x+3.31，n=101，r2=0.27，P＜0.001），真阳性率是13.9%，真阴性率是96.9%。XT-4000i检测的另一研究参数嗜酸性粒细胞（EO-BF）水平与人工显微镜方法的相关性无统计学意义（P＞0.05），真阳性率是9.8%，真阴性率是80.0%。XT-4000i的白细胞、单个核细胞、多个核细胞和红细胞计数均表现出良好的精密度（CV≤30%）。白细胞计数和红细胞计数具有良好的携带污染率（carry-over≤0.3%）和线性分析（r2=0.99）。结论 XT-4000i体液模式的准确度和精密度良好，可用于日常脑脊液细胞计数。高荧光强度细胞水平对脑脊液中的大细胞具有一定的提示预测作用。

脑脊髓液 血细胞计数 血细胞分析仪 Sysmex XT-4000i

正常成年人的脑脊液约100～150 ml，具有一定的化学成分和压力，对维持颅压的相对稳定有重要作用。当患脑外伤、脑膜炎、脑出血和中枢神经梅毒等中枢神经系统疾病时，常常要作腰椎穿刺吸取脑脊液检查，以协助诊断[1，2]。

脑脊液细胞计数和分类是临床基础检验中的一项常规试验，对于诊断和鉴别诊断中枢神经系统疾病具有重要作用。人工灌板显微镜计数是检测脑脊液细胞数量的传统方法[3]。但该法存在操作繁琐费时、重复性差、操作者个体间差异等缺点，难以进行质量控制。因此，需要克服耗时长、精密度和准确度差的自动化仪器替代人工计数方法。血细胞分析仪Sysmex XT-4000i（日本）具有专门的体液（body fluid，BF）分析模式，采用鞘流原理、荧光染色和半导体激光流式细胞术等技术[4，5]，可进行脑脊液、胸腹水、心包积液、关节腔积液等体液标本的常规检测，报告白细胞（WBC-BF）、单个核细胞（MN）和多个核细胞（PMN）、红细胞 （RBC-BF）参数。此外，还检测2个研究参数：高荧光强度细胞（HF-BF）和嗜酸性粒细胞（EO-BF）。国内已有研究报道自动化仪器体液分析模式的应用[4-6]，但鲜有研究利用脑脊液大样本且采用细胞甩片离心染色方法，作为白细胞分类的参考方法对自动化体液分析各项参数进行全面的性能评价。本研究同时采用仪器检测、灌板计数和细胞离心染色方法，评价XT-4000i体液分析模式检测脑脊液中WBC-BF、MN、PMN、RBC-BF的精密度、准确度、线性范围、携带污染率等性能指标，分析2个研究参数HF-BF和EO-BF对于脑脊液中大细胞和嗜酸性粒细胞是否具有提示预测作用，探讨 XT-4000i体液模式能否替代人工显微镜计数方法用于日常脑脊液标本检测。

材料与方法

1 材料 收集山东省立医院2015年6～12月住院患者脑脊液标本142 份，用普通试管收集，收到标本2 h内同时采用人工显微镜方法和Sysmex XT-4000i 体液分析模式进行检测，人工显微镜检测由经验丰富的技师完成。标本采集和细胞成分分析遵循CLSI H56-A指南。

2 方法

2.1 人工显微镜方法

2.1.1 人工灌板显微镜计数：白细胞（WBC）和红细胞（RBC）计数采用改良牛鲍氏计数板。灌板前轻轻混匀标本，用微量移液器吸取10μl脑脊液灌板，在显微镜高倍镜（×400）下计数。对于WBC＜50×106/L的标本，要求计数两侧10个大方格；对于WBC≥50×106/L的标本，要求计数5个大方格，结果乘以2。由2位经验丰富的技师计数，结果取均值。

2.1.2 细胞离心染色计数：将脑脊液用专门的细胞涂片离心机（Dettolx DB-CC2，美国）800 r /min离心6 min，然后将得到的细胞涂片作Wright-Giemsa染色，在显微镜油镜（×1 000）下计数分类100个白细胞，将淋巴细胞、单核细胞及浆细胞归为单个核细胞，将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞归为多个核细胞。室管膜细胞和蛛网膜细胞不计入白细胞。若存在大细胞，如吞噬细胞、白血病细胞和癌细胞，则另外记录。恶性细胞的报告由2名副主任技师以上进行确认。

2.2 Sysmex XT-4000i 体液分析模式检测

2.2.1 计数和分类：计数脑脊液中WBC-BF、MN、PMN、RBC-BF及2个研究参数HF-BF和EOBF。HF-BF理论上指间皮细胞、吞噬细胞、恶性细胞等，不计入白细胞（WBC-BF），但计入总的有核细胞（TC-BF ）。HF-BF% 指高荧光强度细胞数量/100个白细胞，EO-BF% 指嗜酸性粒细胞数量/100个白细胞。

2.2.2 批内精密度：分别对WBC-BF、MN#、PMN#、RBC-BF做批内精密度的评估。选取低、中、高值脑脊液标本各连续检测11次，去掉第1次，取10次的均值，求标准差（s）和变异系数（CV）。根据仪器说明，WBC-BF和RBC-BF的CV应 ≤ 30%.

2.2.3 线性分析：WBC-BF高值和低值线性范围的验证，分别选取WBC-BF接近预期上限和低值的脑脊液标本，用Sysmex XT-4000i配套鞘液依次稀释100%、80%、60%、40%、20%、5%…，每个梯度连续检测3次，求均值。对实测值和理论值做相关性分析，求直线回归方程y=a+bx。RBCBF线性范围的验证方案同上。当0.95≤b≤1.05、r≥0.975时，符合要求。

2.2.4 携带污染率：分别对WBC-BF、RBC-BF进行携带污染率的评估。先取一份高值脑脊液标本连续检测3次（H1、H2、H3），然后将配套鞘液作为低值标本连续检测3次（L1、L2、L3）。根据以下公式计算：携带污染率=×100%，根据仪器说明，WBC-BF和RBC-BF携带污染率应≤0.3%。

2.2.5 准确度：将仪器自动计数和人工显微镜计数脑脊液WBC-BF、MN%、PMN%、RBC-BF的结果进行相关回归分析，求直线回归方程y=a+bx，以确定二者之间的符合程度。对高荧光强度细胞和嗜酸性粒细胞这2个研究参数，除进行相关回归分析外，还进行敏感度和特异度分析。

3 统计学处理 应用Microsoft Excel 2007 和GraphPad Prism 5 Software（美国）分析数据。线性范围的验证和方法间的比较采用Passing-Bablok回归分析，求直线回归方程y=a+bx。

结 果

1 精密度 WBC-BF、MN #、PMN#、RBC-BF的低值、中值、高值脑脊液标本的批内精密度CV依次降低，均≤30%，符合仪器说明书要求，见表1。

2 线性分析 WBC高值线性、低值线性及RBC线性验证见图1，其决定系数r2均为0.99。

3 携带污染率 WBC-BF、RBC-BF的低值、高值脑脊液标本携带污染率均≤0.3%，符合仪器说明书要求，见表2。

4 准确度 共有142份脑脊液标本用于比较仪器自动计数和人工显微镜计数。根据文献报道，自动化体液分析白细胞的最低检出限约在5×106/L[7，8]，故统计2种方法间WBC-BF的相关性时，仪器计数WBC-BF ＜ 5×106/L的标本被舍弃，有118份标本纳入统计；统计2种方法间MN （%）、PMN（%）、HF-BF%或EO-BF%的相关性时，细胞离心染色后镜检计数＜100个WBC的标本被舍弃，有101份标本纳入统计；统计2种方法间RBC-BF的相关性时，因为仪器只能报告RBC-BF≥0.1×109/L，所以RBC-BF＜0.1×109/L的标本被舍弃，有62份标本纳入统计。

2种方法间WBC-BF、MN （%）、PMN（%）、RBC-BF的决定系数r2分别为：0.98、0.88、0.88、0.99，均呈高度相关，P＜0.001。HF-BF%的决定系数r2为0.27，P＜0.0001，因此2种方法间高荧光强度细胞的计数相关。2种方法间嗜酸性粒细胞计数的相关性无统计学意义，P＞0.05。 见表3和图2。

表1 批内精密度

图1 XT-4000i体液模式的线性分析

表2 携带污染率

在纳入细胞分类统计的101份脑脊液标本中，仪器计数HF-BF%＞0，同时细胞离心染色后镜检查到吞噬细胞或恶性细胞，被判定为真阳性，真阳性标本共5例，DIFF散点图及相应细胞形态见图3。 同样，仪器计数EO-BF%＞0，同时细胞离心染色后镜检查到嗜酸性粒细胞，被判定为真阳性。HF-BF%和EO-BF%的真阳性率分别是：13.9%、9.8%；真阴性率分别是96.9%、80.0%。见表4。

表3 方法间比较（Passing-Bablok）.

图2 比较XT-4000i和人工显微镜计数两种方法

图3 脑脊液中高荧光强度细胞的DIFF散点图和细胞形态图（瑞氏染色，×1 000）

表4 仪器计数HF-BF%和EO-BF%的灵敏度和特异度

讨 论

近年来推出的一些自动化血细胞分析仪Sysmex XT-4000i、XE-5000、XN系列等，具有专门的体液通道分析模式可以进行体液细胞计数和分类。由于这类仪器采用鞘流原理、半导体激光、荧光染色和流式细胞术原理，细胞计数的准确度和精密度大大提高[4-13]。

本研究对XT-4000i进行了全面的性能评估，WBC-BF、MN#、PMN#、RBC-BF 4个参数均表现出良好的批内精密度、线性范围、携带污染率和准确度。为保证仪器检测和人工计数的准确性和重复性，我们采取了一系列质量控制措施。由于脑脊液细胞易破坏，标本不宜放置过长时间，我们要求标本在送检后2 h内完成检测，并且破碎细胞超过5%的标本不纳入统计分析。在进行精密度分析时，我们轻轻混匀标本后，连做2次仪器检测，然后再轻轻混匀，连续进行2次仪器检测，同法进行，以减少因多次混匀造成的细胞破坏。我们发现，这种方法检测的精密度CV值比每次检测前都混匀脑脊液的精密度CV值显著减低（未提供数据）。我们还对人工灌板计数的操作程序作了细致要求（见方法部分），以减少人员间差异。白细胞分类的传统方法是用冰醋酸酸化脑脊液后，计数单个核细胞（MN）和多个核细胞（PMN）的百分比[3]。但这种方法存在着一些局限性，不宜作为金标准。首先冰醋酸的残余量会影响脑脊液细胞计数；其次中性粒细胞的杆状核在镜下不易辨别和划分为单个核细胞还是多个核细胞；第三白细胞数量较低的标本无法准确计数单个核细胞和多个核细胞的百分比。因此，我们采用专门的细胞涂片离心机（Dettolx DB-CC2）甩片，使细胞浓集，由于该离心机转速低，对细胞破坏小，能保证细胞形态的完整性。Wright-Giemsa染色后，油镜下分类。这种方法可以避免冰醋酸酸化法分类的弊端。国外同类研究报道多采用细胞离心染色方法作为脑脊液及其他体液标本中白细胞分类的参考方法[9-13]。

本研究还对2个研究参数高荧光强度细胞和嗜酸性粒细胞的准确度进行了评估。结果表明，脑脊液中HF-BF水平与人工显微镜下能否查到大细胞（吞噬细胞、白血病细胞或肿瘤细胞）是相关的（P＜0.001）。但是，与查到吞噬细胞的脑脊液标本相比，查到白血病细胞或肿瘤细胞的脑脊液并非都表现出更高的HF-BF水平，这一点与最近的自动化血细胞分析仪检测脑脊液细胞研究一致[12，13]，这是因为恶性细胞有可能被仪器归到单个核细胞中。由于我们收集的脑脊液标本中能查到大细胞的例数较少，所以未能进行良恶性脑脊液标本HF-BF水平的比较。脑脊液HF-BF的假阳性率相当高 （86.1%），假阴性率相当低（3.1%），表明HF-BF对于大细胞的阴性预测值显著高于其阳性预测值。我们的结果还表明，脑脊液中EO-BF水平与人工显微镜下能否查到嗜酸性粒细胞不相关（P＞0.05），对脑脊液中是否具有嗜酸性粒细胞不具有提示价值。

综上所述，自动血细胞分析仪XT-4000i体液分析模式是一种快速、准确、灵敏地计数和分类脑脊液细胞的方法。但是，对于白细胞计数较低的标本，建议仍采用灌板计数法，因为仪器具有检测下限。另外，高荧光强度细胞对脑脊液中大细胞检测具有一定的预测价值，当HF-BF增高时，建议进行细胞离心染色，以避免恶性细胞漏诊。

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Performance Estimation of Sysmex XT-4000i in Body Fluid Mode for Counting Blood Cells in Cerebrospinal Fluid

GENG Li-li，LIU Yi-qing，WANG Ze-jun，et al. Department of Clinical Laboratory，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Shandong Jinan250021

Objective To evaluate the performance of the body fluid （BF）mode on Sysmex XT-4000i for counting blood cells in cerebrospinal fluid （CSF）. Methods One hundred and forty -two CSF specimens were collected from the inpatients in Shandong Provincial Hospital from June to December，2015. Blood cells of all the specimens were counted for method comparison between Sysmex XT-4000i and manual microscope （counting chamber and stained cytospin slides）. Results Excellent correlations were found for counting white blood cells （y=1.17x+3.21，n=118，r2=0.98），mononuclear cells （y=0.81x+13.61，n=101，r2=0.88），polynuclear cells （y=0.82x+5.15，n=101，r2=0.88）and red blood cells （y = 1.01x+146.40，n= 62，r2= 0.99）. Good agreement was found between levels of high fluorescent（HF）cells detected by XT-4000i and large cells （macrophages or malignant cells）found under the microscope （y =0.54x+3.31，n= 101，r2= 0.27，P＜0.000 1）. The true positive rate of HF cells was 13.9% and their true negative rate was 96.9%. However，no correlation was found between eosnophils detected by XT-4000i and under the microscope （P＞0.05）. The true positive rate of eosnophils was 9.8% and their true negative rate was 80.0%. Good precision （CV≤30%）was got in white blood cells，mononuclear cells，polynuclear cells and red blood cells counted by XT-4000i. Both carryover （≤0.3%）and linearity （r2=0.99）were also excellent for white blood cells and red blood cells. Conclusion The BF mode on XT-4000i may be routinely used for CSF cells count because of its excellent accuracy and precision. HF cells may have some predictive value in large cells in CSF.

Cerebrospinal fluid Blood cell count Hematology analyzer Sysmex XT-4000i

R446.1

A

1671-2587（2017）06-0630-06

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.030

*本课题受山东省自然科学基金（No.ZR2016HM52）；山东省科学技术发展计划资助项目（No.2014GGH218041）；山东省临床重点专科项目（No.鲁卫医字[2013]26号）资助

250021 济南，山东大学附属省立医院临床医学检验部

耿丽丽（1989–），女，山东济南人，检验师，学士，主要从事临床检验工作，（ E-mail）408052812@qq.com。

刘义庆，男，博士，主治医师，主要从事临床检验工作，（ E-mail）yqliu1979@163.com。

2017-08-02）

（本文编辑：王敏）