碳青霉烯中介肠杆菌科细菌耐药性及相关基因检测

张霞 朱超望 王莹超 眭阳 尹娟

碳青霉烯中介肠杆菌科细菌耐药性及相关基因检测

张霞 朱超望 王莹超 眭阳 尹娟

目的 分析碳青霉烯类药物敏感性中介肠杆菌科细菌（Carbapenem-intermediate Enterobacteriaceae，CIE）的耐药特性及其携带碳青霉烯酶基因情况。方法 收集2015年3月～2017年1月南京医科大学附属苏州医院北区分离的26株CIE，分析菌株对抗菌药物的敏感性，并通过聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）筛选碳青霉烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和OXA48基因。结果 26株临床分离的CIE菌株中，对氨苄西林、头孢唑林、头孢他啶等药物耐受均达到80%以上，PCR法检测到6株细菌携带碳青霉烯酶基因，包括KPC 4株、NDM 1株、IMP 1株。结论 碳青霉烯中介肠杆菌科细菌多重耐药率较高，且检出碳青霉烯酶基因的菌株也占一定比例，需进一步加强临床多重耐药细菌的监测。

肠杆菌科细菌 多重耐药 碳青霉烯酶基因

肠杆菌科细菌为革兰阴性菌，是临床常见和易分离的病原菌，常引起患者严重感染和医院获得性感染。β内酰胺类抗生素一直是治疗严重肠杆菌科细菌感染最成功的抗生素，随着抗菌药的广泛应用尤其是不合理用药，产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶的细菌不断增加，碳青霉烯类抗菌药被认为是治疗多重耐药特别是产ESBLs 酶肠杆菌科细菌的有力武器，是治疗ESBL菌株的最后一道防线。但是近年来，随着碳青霉烯类抗菌药的大量使用，临床出现耐碳青霉烯类

抗菌药的肠杆菌科细菌（ Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE），且逐年增加，给临床治疗和院内感染控制带来极大困难[1]，尤其自本世纪初，出现了产碳青霉烯酶的菌株而导致对碳青霉烯类药物耐药，并蔓延全球。这些CRE菌株感染都伴随着高发病率和死亡率，特别是在医院环境中的高危患者，成为全世界医院获得性感染中导致高发病率和死亡率的一个主要原因[2-4]。目前有较多对耐碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的研究[5-8]，但对于碳青霉烯药物敏感性为中介的肠杆菌科细菌的研究极少。为此，本院对CIE临床分离株进行调查，分析该类细菌对抗菌药物的敏感性，并分析其携带碳青霉烯基因情况，为临床细菌耐药防控策略制订提供依据。

材料与方法

1 材料 2015年3月～2017年1月南京医科大学附属苏州医院北区收集的26株非重复CIE临床分离株，其中大肠埃希菌10株、肺炎克雷伯菌8株、沙雷菌属4株、阴沟肠杆菌3株、产气肠杆菌1株。

2 仪器与试剂 使用法国生物梅里埃公司ATB Expression 细菌鉴定仪对菌株进行鉴定。PCR扩增仪为美国ABI公司产品。药敏纸片：亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢唑林、头孢噻肟、头孢他啶、哌拉西林、氨苄西林、四环素、环丙沙星、庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、粘菌素及M-H干粉培养基均购自英国Oxoid公司。PCR试剂、DNA Ladder 购自Sigma公司。

3 药敏试验 采用Kirby- Bauer 纸片（K-B）琼脂扩散法测定抗菌药物对菌株抑菌圈的直径。结果按美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准判断敏感、中介或耐药[9]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

4 碳青霉烯酶基因检测分析 利用煮沸法提取细菌DNA。聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增碳青霉烯酶基因：KPC、IMP、VIM、NDM和OXA48基因，引物见表1。PCR反应体系：95℃预变性10 min；然后变性95℃ 30 s，退火时间30 s，退火温度分别为52℃、54℃、55℃、56℃，72℃延伸30 s，30个循环；最后再72℃延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，核酸染色剂使用GoldView1型，紫外灯下观察结果，将目的片段大小一致的阳性标本PCR产物，送上海生物工程股份有限公司进一步测序验证结果，所测序列与GenBank中BLAST程序中的序列比对。

表1 碳青霉烯酶基因引物

结 果

1 耐药情况分析 26株碳青霉烯药物敏感性为中介的肠杆菌科细菌大多表现为多重耐药，其对第三、第四代头孢菌素等多种β‐内酰胺类抗生素的耐药率较高，对氨苄西林、哌拉西林、头孢他啶、头孢唑林、头孢噻肟、阿莫西林/克拉维酸的耐受均达到80%以上，对粘菌素均敏感，见表2。2 碳青霉烯酶基因PCR扩增和测序结果 26株临床分离的CIE中，有6株（23.1%）检测到碳青霉烯酶基因，其中KPC阳性（ 448 bp） 4株（图1），NDM阳性（292 bp） 1株（图2），IMP阳性（587 bp） 1株（图3），PCR产物送上海生物工程股份有限公司进一步测序验证，所测序列与GenBank中BLAST程序中的序列比对，证实PCR阳性结果均正确。

讨 论

目前，细菌耐药性已成为全球关注的问题，耐药细菌所致感染己成为临床抗感染治疗的新挑战，是当前人类健康和生命的主要威胁。肠杆菌科细菌分布广，与人类关系密切。在医院感染中，肠杆菌科细菌中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等是引起医院感染最常见的病原菌，并以多重耐药菌株引起的感染为显著特点。美国更是将控制耐药细菌提升到了国家战略，提出其核心是碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）。对CRE菌株耐药机制的研究可解释细菌对抗生素耐药的分子机制以及耐药决定子的传播方式，可作为临床用药的参考，有助于减少或延缓耐药性的发生、感染控制及新药开发等，具有重要的临床价值。

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要有以下四个方面：①产生水解碳青霉烯类抗菌药的碳青霉烯酶（如KPC，NDM，VIM，IMP和OXA-48）；②外膜蛋白 （ OmpF、OmpC等） 的缺失或数量减少，伴高产AmpC酶、ESBLs 酶等；③主动外排泵系统的活跃；④药物作用靶位的改变，主要为青霉素结合蛋白PBP的改变。在上述几种耐药机制中，产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最主要的机制[10]。碳青霉烯酶的编码基因定位在质粒、整合子等可转移的基因元件上，且肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药主要由质粒介导[11-14]，耐药基因容易随质粒在不同菌种之间传播，造成耐药性的扩散。

表2 26株碳青霉烯药物敏感性为中介的肠杆菌科细菌对常用抗菌药物的药敏试验（n，%）

图1 KPC基因PCR检测结果

图2 NDM基因PCR检测结果

图3 IMP基因PCR检测结果

碳青霉烯类抗菌药作为治疗多重耐药特别是产ESBLs 酶肠杆菌科细菌的最后一道防线，细菌对其敏感性降低必需引起临床重视，包括对碳青霉烯药物敏感性中介的肠杆菌科细菌。本研究分析了临床分离的26株碳青霉烯药物中介的肠杆菌科细菌，发现大多表现为多重耐药，其对第三、第四代头孢菌素等多种β‐内酰胺类抗生素的耐药率较高，对氨苄西林、哌拉西林、头孢他啶、头孢唑林、头孢噻肟、阿莫西林/克拉维酸的耐受均达到80%以上。通过PCR检测这些菌株携带碳青霉烯酶基因发现：KPC阳性4株，NDM阳性1株，IMP阳性1株，共有6株检测到碳青霉烯酶基因，占全部菌株的23.1%。

综上，临床碳青霉烯药物中介的肠杆菌科细菌大多表现为多重耐药，临床治疗该类细菌感染可根据药敏结果选用抗菌药物，并需结合微生物学和分子生物学方法监测其在医院内的传播情况，以指导临床合理使用抗菌药物。

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Investigate on the Carbapenemases Genes and Drug Resistance in Carbapenem-intermediate Enterobacteriaceae

ZHANG Xia，ZHU Chao-wang，WANG Ying-chao，et al. Department of Clinical Laboratory，The North District of Affiliated Suzhou Hospital，Nanjing Medical University，Suzhou215008

Objective To investigate the drug resistance of Carbapenem-intermediate Enterobacteriaceae（CIE），and whether carrying carbapenemases gene. Methods 26 CIE isolates were collected from March 2015 to January 2017 in the North District of Affiliated Suzhou Hospital，Nanjing Medical University，drug resistance of these isolates were investigated by antibiotic susceptibility testing. Carbapenemase genes KPC，NDM，IMP，VIM and OXA48 were detected by polymerase chain reaction （PCR）. Results More than 80% of 26 CIE clinical isolates were resistance to ampicillin，cefazolin，ceftazidime. PCR detected 6 isolates carrying carbapenemase genes，including 4 isolates of KPC，1 isolate of NDM and 1 isolate was IMP positive. Conclusion The multidrug resistance rate in carbapenems-intermediate Enterobacteriaceae was high，and the carbapenemases gene positive isolates were also account for a certain proportion，which suggests that the clinical monitoring of multiple drug-resistant bacteria needs to be further strengthen.

Enterobacteriaceae Multidrug resistance Carbapenemases gene

R378.2 R392.11

A

1671-2587（2017）06-0614-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.025

215008 苏州，南京医科大学附属苏州医院北区检验科

张霞（1975–），女，江苏南通人，副主任技师，学士，主要从事临床检验工作，（Tel）13962164303（E-mail）616463097@qq.com。

2017-03-17）

（本文编辑：王敏）