地衣内生真菌的鉴定及其抗植物病原菌活性

范莉莉　秦正男　郭守玉　韩留福

摘要：以粉缘斑叶梅（Cetrelia cetrarioides）、粉树花（Ramalina farinacea）、東方松萝（Usnea orientalis）3种地衣为试验材料，进行内生真菌分离、鉴定、物种多样性、ITS（internal transcribed spacer）序列系统发育分析以及抗植物病原菌活性的初步研究。物种多样性研究结果表明，3种地衣体中分离共获得29株内生真菌，确定隶属于4科8属；其中，炭角菌属为3种地衣内生真菌的优势属。地衣内生真菌粗提发酵液对镰刀菌（Fusarium sp）、多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）、黄瓜萎蔫病菌（Plectosphaerella cucumerina）、Pythium capillosum等4种供试植物病原菌抗菌活性试验结果表明，东方松萝中的内生真菌C25、C27和C49效果良好，有潜在的生物防治应用价值。

关键词：地衣；内生真菌；分类；鉴定；抗病原菌活性；优势属；生物防治

中图分类号： S94932；S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0115-04

收稿日期：2017-04-18

基金项目：国家自然科学基金（编号：31370067）；湖北省重点实验室开放基金（编号：2012snjAB001）；河北省自然科学基金（编号：C2016205201）

作者简介：范莉莉（1989—），女，河北邯郸人，硕士研究生，主要从事地衣内生真菌资源研究。E-mail：lilifan0529@163com。

通信作者：韩留福，博士，教授，主要从事地衣生物学研究。E-mail：hanliufu@hebtueducn。

植物内生真菌（endophytic fungi）是指寄生于健康植物组织内，但不会引起宿主植物出现不良症状的一类微生物1]。Clay等发现侵染内生真菌的牧草遭受到真菌病害影响的程度远低于没有感染内生真菌的，感染内生真菌的宿主植物往往比未感染植株更具生存竞争力2-3]。药用植物体内存在能产生与宿主植物活性成分物质相同或相似的次生代谢产物，这些代谢产物在新型药物开发和生物防治等方面具有巨大的潜在应用价值4-6]。近年来，随着越来越多的具有抗菌活性菌株被发现，植物内生真菌逐渐成为研究的热点。

目前人们仅仅利用植物内生真菌的小部分，还有很多未从植物体内分离、培养、开发利用。国内外对内生真菌的研究主要集中在高等植物中，对低等植物尤其是地衣的研究较少7-9]。事实上，内生真菌作为一个较大的生物类群，也广泛存在于地衣组织中10-12]。在药用研究方面，从扁枝衣分离获得的6株内生真菌通过平板对峙法进行抗菌活性研究发现，2株产生明显的拮抗带，抑菌效果显著，是良好的生物防治候选菌株13]。总之，地衣内生真菌作为一类重要的真菌资源，它们的药用价值和生态价值尚未被有效开发利用。本研究以采自神农架林区的药用地衣粉缘斑叶梅（Cetrelia cetrarioides）、粉树花（Ramalina farinacea）、东方松萝（Usnea orientalis）为材料，进行内生真菌的分离培养、种类多样性分析和抗植物病原菌活性菌株筛选，旨在为丰富地衣内生真菌资源，并为植物病害的生物防治提供资料。

1材料与方法

11样本采集

2014年4月从湖北省神农架林区海拔2 150 m的树枝或树干上随机采集粉缘斑叶梅、粉树花、东方松萝等地衣标本。在实验室温度为4 ℃条件下保存，并在5～7 d处理完毕。试验所用地衣样本及分离的内生真菌菌株均保存在中国科学院微生物所标本室（HMAS-L）、河北师范大学标本室（HBNU-L）中。

12内生真菌的分离、纯化和分类鉴定

菌株分离：（1）样本清洗。选取适量样本，自来水冲洗 1～2 h，剔除表面杂物；在超净台上，用紫外照射上下表面各10 min。（2）表面消毒。无菌水涮洗3遍，75%乙醇消毒 30 s，3% NaClO溶液消毒3 min，75%乙醇消毒30 s，无菌水涮洗3遍，置于无菌吸水纸上。（3）分离方法。剪碎消毒样本，置于加入400 μL无菌水的20 mL离心管中，玻璃棒研磨；涂布接种；20 ℃条件下培养。

菌株纯化：待培养基长出菌落后，采用顶端纯化法，转接至新PDA培养基上，多次纯化，直到得到单一、稳定的菌落，4 ℃ 条件下保存。

分类鉴定：利用解剖镜观察菌落特征；采用插片法对菌丝和孢子进行形态学观察。通过DNA提取，PCR扩增，获得nrDNA的ITS序列，经校正后，NCBI在线进行Blast比对，确定一致性最高的同源序列，结合菌落形态和显微特征，进行内生真菌分类鉴定14-15]。

13内生真菌发酵液的抗菌活性试验方法

4种供试植物病原菌包括镰刀菌（Fusarium sp）、多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）、黄瓜萎蔫病菌 （Plectosphaerella cucumerina）、Pythium capillosum以及阳性对照菌球毛壳菌（Chaetomium globosum），均由河北师范大学地衣生物学实验室提供。

试验步骤：（1）菌株活化。取出在4 ℃条件下保存的地衣内生真菌，于PDA培养基中活化，25 ℃条件下培养6～7 d。（2）摇瓶发酵培养16]。取适量活化菌株接种于200 mL PDB液体培养基中，25 ℃、150 rmin摇床振荡培养7～15 d。（3）粗提液制备。将内生真菌发酵液离心、过滤，取上清液进行丙酮浸提，获得粗提液。（4）粗提液培养基制备。将粗提液加入PDA培养基（二者体积比为1 ∶20）混匀，制成粗提液培养基。以球毛壳菌粗提液培养基作为阳性对照1，以无菌水加入等量丙酮培养基作为对照2。（5）抗菌活性测试。接种植物病原菌于培养基中央，25 ℃条件下培养。十字交叉法测量病原菌菌落直径（cm），按照下面公式计算其抑菌率17]：endprint

抑菌率=对照生长量（cm）-处理生长量（cm）]对照生长量（cm）×100%。

2结果与分析

21分离结果

从3种地衣样本的150块组织中分离共获得29株内生真菌，定殖率为1933%。其中，从叶状地衣粉缘斑叶梅中分离获得9株内生真菌（C21、C22、C23、C39、C54、C55、C60、C61、C63），定殖率为3000%；从枝状地衣粉树花中获得11株内生真菌（C31、C32、C33、C36、C38、C40、C51、C52、C53、C57和C58），定殖率为1833%；从枝状地衣东方松萝中分离获得9株内生真菌（C25、C27、C35、C42、C45、C49、C50、C59和C65），定殖率为1500%（表1）。结果表明，叶状地衣定殖率高于枝状地衣。

22地衣内生真菌的物种多样性

对地衣内生真菌菌落特征进行简要描述（表2、图1）。利用测得nrDNA-ITS序列与GenBank中已注册信息在线比对，结果如表2所示；基于nrDNA-ITS序列信息，利用Mega 6软件构建地衣内生真菌与其他相关真菌类群的邻接（neighbor-joining，简称NJ）系统发育树（图2），系统树的每个分支的统计学显著性分析以Bootstrap方法进行检验，重复1 000次。结果表明，29株内生真菌确定隶属于8属，其中炭角菌属（Xylaria）有12株菌株，占4138%，为3种地衣内生真菌的优势属。

23发酵粗提液的抗菌活性

由表3可知，对照1（球毛壳菌）对植物病原菌表现出一定的抑菌效果；对照2（无菌水加丙酮）对植物病原菌均无抑菌效果；C25发酵粗提液对镰刀菌、多枝横梗霉的抑菌率分别为3326%、3287%，对黄瓜萎蔫病菌和P capillosum的抑菌率达95%以上；C27发酵粗提液对镰刀菌、黄瓜萎蔫病菌的抑菌率分别为1338%、1564%，对Pcapillosum表现为完全抑制；对多枝横梗霉的抑菌率约为4965%；C49发酵粗提液对黄瓜萎蔫病菌和P capillosum的抑菌率达均到90%以上，对镰刀菌的抑菌率约为4567%，对多枝横梗霉的抑菌率为1042%。其他内生真菌发酵粗提液均未发现抑菌效果。

试验结果表明，东方松萝内生真菌C25、C27、C49的发酵粗提液对植物病原菌的抑菌效果较好且具有广谱性。

3结论与讨论

目前真菌鉴定主要基于形态学特征和特定的分子序列差异，其中ITS序列分析法鉴定种间关系准确性相对较高，简单易行，具有巨大的應用价值18]。本试验对内生真菌进行ITS序列分析、系统发育树构建、辅助形态学鉴定以及内生真菌分类地位的确定。

植物内生真菌作为一种新兴的微生物资源，具有广阔的开发前景19]。已有研究发现，植物内生真菌具有广泛的抗菌活性20]。通过对3种地衣内生真菌发酵粗提液的抗植物病原菌活性试验发现，3株分离自东方松萝的地衣内生真菌C25、C27和C49抑菌率较高，具有较好的抗菌活性，有望成为很好的生物防治菌，在农作物病害预防中可以发挥重要的作用。

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