甜菊糖浸提液的絮凝工艺研究

李雪，吕爱弟，乔长晟，，*

（1.天津北洋百川生物技术有限公司，天津300457；2.天津科技大学生物工程学院，天津300457）

甜菊糖浸提液的絮凝工艺研究

李雪1，吕爱弟2，乔长晟1，2，*

（1.天津北洋百川生物技术有限公司，天津300457；2.天津科技大学生物工程学院，天津300457）

研究甜菊糖的提取工艺，以絮凝阶段为主要研究点，探讨新的絮凝剂-壳聚糖对甜菊糖浸提液絮凝工艺效果进行试验研究。在单因素试验的基础上，利用响应面法对甜菊糖浸提液的絮凝条件进行优化，建立了二次回归模型，通过分析得出，确定壳聚糖的添加工艺为：第1、4次浸提液中添加分子量为150 kDa、0.3 mL 1%壳聚糖溶液中添加1 g甜菊叶（干重）、絮凝温度为48℃、絮凝时间为2.9 h，甜菊糖的保留率为92.36%，溶液澄清率为94.17%。第2、3次浸提液中添加分子量为50 kDa的壳聚糖，添加量为0.3 mL1%壳聚糖溶液/g甜菊叶，31℃下絮凝1.9 h，甜菊糖的保留率为93.61%，溶液澄清率为96.01%。新的絮凝剂-壳聚糖避免了对生产设备的腐蚀，大大降低了生产成本，同时也减轻了对环境的污染。

甜菊糖；提取；絮凝剂；壳聚糖

甜菊糖甙，又称甜菊苷，它是从菊科植物甜叶菊的叶子中提取出来的一种糖苷。其甜度为蔗糖的200倍～300倍[1]，能够代替人工甜味剂[2]，现已被日本、巴西、中国等多个国家广泛应用于食品、日化、医药等领域[3-4]。早在1985年6月5日（85）卫防字第37号文中，我国卫生部就已证明了甜菊糖甙的安全性。WHO第63届会议（2006）上确定了临时每日允许摄入量为0～2 mg/kg bw/d。食品添加剂联合专家委员会完成了关于甜菊糖甙（WHO，2008）临床研究，在WHO第69届会议上将每日允许摄入量提高到4 mg/kg bw/d。甜菊糖甙还可以预防龋齿、肥胖症和糖尿病，且具有热量低、安全性高、稳定性好的特点。

甜菊糖甙中共有9种甜味成分，其中甜菊甙（简称ST）占总甙的55%～65%，莱鲍迪甙A（简称RA）占总甙的22%～28%[5]。ST的甜味强度是蔗糖的250倍～300倍，但是其被人的嗅觉感知的速度比较慢且具有一定的后苦味，RA的甜味强度是蔗糖的350倍～450倍，甜度大且与蔗糖口感接近，被认为是最理想的甜味剂[6-7]。目前，甜菊糖甙产品市场主要是中国和日本[8]。除ST和RA外，其它相关的糖甙包括莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙F、杜尔克甙A、悬钩子甙和甜菊双糖甙。甜菊糖甙中这几种成分的含量通常低于甜菊甙和莱鲍迪甙A。它们拥有共同的基础结构-糖苷配基（stevio L）。只是C13和C19位上糖残基的数量和种类不同，这也是它们的甜度和口感存在差异的原因[9]。甜菊糖甙的结构式如图1[10]。

图1 甜菊糖甙的分子结构Fig.1 The molecular structure of stevioside

在甜菊叶浸提完成后，通过在浸提液中加入一定量的絮凝剂使得悬浮微粒集聚变大，或形成絮团，从而加快粒子的聚沉，从而达到固-液分离的目的。张雪颖等通过比较几种絮凝剂的效果，确定出采用FeCl3与CaO的组合作为絮凝剂效果较好，并对其絮凝条件进行了优化[11]。邵佩霞等提出了高效絮凝—助凝新工艺：选用高分子化合物聚合氯化铝（Polyaluminium Chloride，PAC）、聚丙烯酰胺（Polyacrylamide，PAM）以及CaO作为絮凝剂。相比于原絮凝剂，其脱色率提高了1%左右，甜菊糖甙损失率降低了2%左右[12]。但是由于铝会增加患老年痴呆的几率，目前常用工艺是在搅拌下向浸提液中加入0.76%和0.5%（浸提液质量的百分数）的三氯化铁和氢氧化钙固体进行絮凝。室温下pH值为9～10。化学絮凝剂的加入本身引入了大量的无机离子，在后续的工艺中增加了除去无机离子的步骤，因而增加了生产周期和成本。同时，采用化学絮凝法甜菊糖甙的损失也较大。本研究采用新的絮凝剂—壳聚糖利用两步浸提方法，不仅提高了甜菊糖的浸出率，而且避免了对生产设备的腐蚀，大大降低了生产成本，同时也减轻了对环境的污染。因此，不同的应用领域应该选择性使用适宜的絮凝剂。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

TD L-5-A型高速离心机：上海安亭科学仪器厂生产；UV-1200型紫外可见分光光度计：上海第三分析仪器厂生产；GZ120-S数显型悬臂式恒速强力电动搅拌机：国晶电子有限公司生产；AgiLent 1200液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公生产；204型电子分析天平：瑞士梅特勒-托利多集团生产。

甜菊叶来源于甘肃省酒泉市农户，品种为惠农；该甜菊叶叶片含甜菊糖甙总量约为12%，其中莱苞迪甙 A（RA）约占 50% ，甜菊甙（ST）约占 30%；壳聚糖（食品级）：南通兴成生物制品厂。

1.2 方法

1.2.1 甜菊糖保留率和溶液澄清度的测定[13]

甜菊糖保留率和溶液澄清度的测定参考文献[13]。

1.2.2 壳聚糖溶液的制备方法

在烧杯中，分别加入1 g分子量为25、50、100、150、200、250、300 kDa壳聚糖，分别用100 mL1%的醋酸溶液将1 g壳聚糖溶解，配制成1%的壳聚糖溶液。

1.2.3 甜菊糖浸提液的制备方法

取150 g甜菊叶于5 L量杯中加入1 L水进行第1次浸泡，以加水量的0.5%添加抗坏血酸。搅拌均匀后调整数显型悬臂式恒速强力电动搅拌机的搅拌速度为100 r/m，将量杯置于双数显水浴恒温振荡器中，调整其温度为35℃，搅拌50 min。将提取液放出，此过程控制温度25℃；重复此过程4次，第1、4次浸提液合并；第2、3次浸提液合并。

1.2.4 壳聚糖分子量对其絮凝效果的影响

取广口三角瓶，分别加入200 mL1、4次合并浸提液和 5 mL 分子量分别为 25、50、100、150、200、250、300 kDa的1%壳聚糖溶液，搅拌均匀后45℃絮凝4 h。絮凝结束后，过滤除去絮体，对过滤液进行检测。对2、3次合并浸提液进行同样的试验。

1.2.5 单因素试验

1.2.5.1 添加量对壳聚糖絮凝效果的影响

方法语步常用词汇：scope,field,domain,contain,cover,include,outline，test study,investigate,examine,experiment,discuss,consider,analyze,analysis,use,apply,application等

取200 mL1、4次合并浸提液，按照1%壳聚糖溶液（分子量=150 kDa）与甜菊叶浸提液比例：0.1∶1、0.2∶1、0.3 ∶1、0.4 ∶1、0.5 ∶1、0.6 ∶1、0.7 ∶1、0.8 ∶1、0.9 ∶1、1 ∶1（体积比）进行试验，搅拌均匀后45℃絮凝4 h后进行检测。2、3次浸提液絮凝时使用的壳聚糖分子量=50 kDa，其余条件和操作同1、4次。

1.2.5.2 温度对壳聚糖絮凝效果的影响

取250 mL广口三角瓶，分别加入200 mL1、4次浸提液以及0.75 mL分子量=150 kDa的1%的壳聚糖溶液，搅拌均匀后在不同温度（5℃～80℃，梯度为5℃）下絮凝4 h后检测。2、3次浸提液絮凝时使用的壳聚糖分子量=50 kDa，其余条件和操作同1、4次。

1.2.5.3 絮凝时间对壳聚糖絮凝效果的影响

取250 mL广口三角瓶，分别加入200 mL1、4次浸提液以及0.75 mL分子量=150 kDa的1%的壳聚糖溶液，搅拌均匀后在50℃下分别絮凝1 h～7 h（梯度为1h）后检测。2、3次浸提液絮凝时使用的壳聚糖分子量=50 kDa，絮凝温度为30℃，其余条件和操作同1、4次。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖分子量对絮凝效果的影响

壳聚糖作为一种天然高分子絮凝剂，脱乙酰度越高则其相对分质量越低。而相对分子质量越高，则其黏度越大，絮凝效果也越好，但对溶液中有效成分的损失也可能会更大[14]。第1、4次合并浸提液和第2、3次合并浸提液中含有的杂质和甜菊糖含量都不同，因此，要针对两种浸提液分别探究壳聚糖对其澄清率和甜菊糖保留率的影响见图2。

图2 壳聚糖分子量对1、4次合并液（a）和2、3次（b）合并液澄清率和甜菊糖保留率的影响Fig.2 Effect of chitosan molecular weight on clarification rate and retention rate of the first and the fourth extracts（a），the second and the third extracts（b）

从图2（a）看出，在1、4次合并液絮凝时，壳聚糖的分子量为150 kDa时溶液中甜菊糖的保留率为94.6%，同时溶液的澄清率达到82.42%。在壳聚糖分子量＜150 kDa时，随着分子量的增大，溶液中甜菊糖的保留率逐渐降低，而溶液的澄清率大幅度升高。当壳聚糖分子量＞150 kDa时，溶液中甜菊糖的保留率开始大幅度降低，而溶液的澄清率也开始大幅度下降。从图2（b）可以看出，壳聚糖分子量为50 kDa时，2、3次合并液中甜菊糖的保留率为94.3%，溶液澄清率为93.95%。随着壳聚糖分子量的增加，溶液中甜菊糖的保留率和溶液的澄清率的变化规律同1、4次合并液。因此适用于2、3次合并液絮凝的较佳壳聚糖分子量是50 kDa，这可能是因为2、3次合并液中杂质和甜菊糖的含量都比1、4次合并液中要少，所以，粘度较小及分子量较小的壳聚糖就能起到很好的絮凝效果，反而大分子量的壳聚糖会使得甜菊糖的损失率增大，而且也会由于其在溶液中过剩而使得溶液的澄清率下降。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 壳聚糖添加量对絮凝效果的影响

壳聚糖添加量对絮凝效果的影响见图3

图3 壳聚糖的添加量对1、4次浸提液（a）和2、3次浸提液（b）澄清率和甜菊糖保留率的影响Fig.3 Effect of chitosan adding amount on clarification rate and retention rate of the first and the fourth extracts（a），the second and the third extracts（b）

从图3（a）看出，当添加量为0.6 mL/g时，溶液的澄清率最大为97.72%。但溶液中甜菊糖的保留率最大的添加量是0.3 mL/g，而此时溶液的澄清率为94.52%。当壳聚糖的添加量大于0.3 mL/g时，溶液中RA和ST的保留率大幅度下降。为了保证在提高溶液澄清率的前提下尽量提高溶液中甜菊糖的保留率，选择添加量为0.3 mL/g。从图3（b）看出，随着壳聚糖添加量的增大，溶液中甜菊糖（RA和ST）的保留率和溶液的澄清率的变化趋势大体是一致的。这可能是因为，随着壳聚糖添加量的增加，甜菊糖在溶液中是过剩的。不但造成了甜菊糖的保留率增加还使得溶液的澄清率下降。因此，壳聚糖的添加量选择0.3 mL/g。

2.2.2 温度对壳聚糖絮凝效果的影响

温度对壳聚糖絮凝效果的影响见图4。

图4 温度对1、4次浸提液（a）和2、3次浸提液（b）澄清率和甜菊糖保留率的影响Fig.4 Effect of temperature on clarification rate and retention rate of the first and the fourth extracts（a），the second and the third extracts（b）

从图4（a）中看出，当温度低于50℃时，随着温度升高，溶液中甜菊糖的保留率略有下降但变化不大，而澄清率快速上升；当温度高于50℃时，溶液的澄清率开始下降，而且溶液中甜菊糖的保留率也快速下降。这可能是随着温度的升高，溶液中的分子运动加剧，壳聚糖分子与杂质分子互相碰撞的几率增大，加速了沉淀过程，澄清率会提高。因此，絮凝温度选择50℃。此时，溶液的澄清率为96.71%，甜菊糖的保留率为83.56%。从图4（b）中可以看出，2、3次浸提液对于温度的反应与1、4次浸提液对于温度的反应大体一致。但由于2、3次浸提液中杂质分子和甜菊糖分子的浓度都较1、4次浸提液低，因此当温度较低时则能够达到较好的澄清效果。因此，絮凝温度选择30℃。此时，溶液的澄清率为94.07%，甜菊糖的保留率为98.58%。

2.2.3 絮凝时间对壳聚糖絮凝效果的影响

絮凝时间对壳聚糖絮凝效果的影响见图5。

图5 絮凝时间对1、4次浸提液（a）和2、3次浸提液（b）澄清率和甜菊糖保留率的影响Fig.5 Effect of time on clarification rate and retention rate of the first and the fourth extracts（a），the second and the third extracts（b）

从图5（a）中看出，絮凝时间＜3 h时，溶液的澄清逐渐增加，当絮凝时间＞3 h后，澄清率基本保持平稳。甜菊糖的保留率在3 h前基本平稳，当絮凝时间＞3 h后，甜菊糖的保留率有所下降。这可能是因为，随着絮凝时间的延长，壳聚糖分子与蛋白质等大分子形成的絮体多且结构稳定。絮凝时间过长时甜菊糖分子会越多的吸附在絮体上，其保留率下降。因此，1、4次浸提液絮凝时间选择3 h。图5（b）看出，甜菊糖的保留率和溶液的澄清率与（a）大致一致，但（b）中的拐点出现在2 h处。这可能是因为，2、3次浸提液中需要絮凝的蛋白质等大分子浓度较低，所以较短时间内即可形成多且结构稳定的絮体。因此，2、3次浸提液絮凝时间选择2 h。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 第1、4次浸提液絮凝的条件优化

用Design Expert中的Box-Benhnken对1、4次浸提液壳聚糖絮凝时的影响因素进行优化。Box-Benhnken共设计了17组试验来寻求添加量、絮凝时间、温度3个因素的最优组合。试验因素及水平如表1所示，试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 The factors and levels of response surface analysis

表2 响应面试验设计及结果表Table 2 The design and results of response surface analysis

利用Design-Expert软件对Box-Benhnken试验结果进行二次多项回归拟合，建立溶液的澄清率对壳聚糖的添加量、絮凝时间和温度三个影响因素的多元二次响应面回归模型，方差分析如表3。

表3 模型及各项的方差分析表Table 3 Analysis of variables for model and items

续表3 模型及各项的方差分析表Continue table 3 Analysis of variables for model and items

得到的二次回归方程为：

式中：Y为溶液的澄清率；A、B、C分别为壳聚糖的添加量、絮凝时间和温度。从方差分析表可知，回归模型大于F值的概率小于0.05，说明该模型的可信度较高，相关系数R2=0.992 6，校正后RAdj2=0.983 0，说明模型可以解释试验所得的溶液澄清率的变化，同时也说明该模型可以用于预测壳聚糖絮凝时溶液澄清率的实际情况。将回归方程分别对A、B、C求一阶偏导数，并令其为0，可以得到一个三元一次方程组，解得回归方程的极值点，带入回归方程，解得溶液的澄清率为94.21%。此时壳聚糖的添加量为0.31 mL/g、絮凝时间为2.92 h，温度为48.11℃。对于壳聚糖絮凝时溶液中甜菊糖的保留率进行同样的方差分析，最终解得溶液中甜菊糖的保留率为92.34%。此时壳聚糖的添加量为0.30 mL/g、絮凝时间为2.90 h、温度为48.09℃。为了便于实际生产，选择壳聚糖的添加量为0.30 mL/g、絮凝时间为2.90 h、温度为48℃。按照此条件进行验证试验，得到溶液的澄清率为94.17%，溶液中甜菊糖的保留率为92.36%。其响应面分析图见图6、图7。

图6 分别为 Y（澄清率）=f（A，B）响应面立体分析图（a）、Y（澄清率）=f（A，C）响应面立体分析图（b）、Y（澄清率）=f（B，C）响应面立体分析图（c）Fig.6 Response surface polt for the function Y（clarification rate）=f（A，B），Y（clarification rate）=f（A，C），Y（clarification rate）=f（B，C）

图7 分别为Y（保留率）=f（A，B）响应面立体分析图（a）、Y（保留率）=f（B，C）响应面立体分析图（b）、Y（保留率）=f（A，C）响应面立体分析图（c）Fig.7 Response surface po Lt for the function Y（retention rate）=f（A，B），Y（retention rate）=f（B，C），Y（retention rate）=f（A，C）

2.3.2 第2、3次浸提液絮凝的条件优化

用Design Expert中的Box-Ben hnken对2、3次浸提液壳聚糖絮凝时的影响因素进行优化。Box-Ben hnken共设计了17组试验来寻求添加量、絮凝时间、温度这3个因素的最优组合。试验因素及水平如表4所示，试验设计及结果如表5所示。

表4 响应面试验因素及水平表Table 4 The factors and levels of response surface analysis

表5 响应面试验设计及结果表Table 5 The design and results of response surface analysis

续表5 响应面试验设计及结果表Continue table 5 The design and results of response surface analysis

利用Design-Expert软件对Box-Benhnken试验结果进行二次多项回归拟合，建立溶液的澄清率对壳聚糖的添加量、絮凝时间和温度3个影响因素的多元二次响应面回归模型，方差分析表如表6。

表6 模型及各项的方差分析表Table 6 Analysis of variables for model and items

得到的二次回归方程为：

式中：Y为溶液的澄清率；A、B、C分别为壳聚糖的添加量、絮凝时间和温度。从方差分析表可知，回归模型大于F值的概率小于0.05，说明该模型的可信度较高，相关系数R2=0.993 1，校正后RAdj2=0.991 4，说明模型可以解释试验所得的溶液澄清率的变化，同时也说明该模型可以用于预测壳聚糖絮凝时溶液澄清率的实际情况。将回归方程分别对A、B、C求一阶偏导数，并令其为0，可以得到一个三元一次方程组，解得回归方程的极值点，带入回归方程，解得溶液的澄清率为96.46%。此时壳聚糖的添加量为0.29 mL/g、絮凝时间为1.92 h，温度为30.99℃。对于壳聚糖絮凝时溶液中甜菊糖的保留率进行同样的方差分析，最终解得溶液中甜菊糖的保留率为93.23%。此时壳聚糖的添加量为0.30 mL/g、絮凝时间为1.89 h、温度为30.93℃。为了便于实际生产，选择壳聚糖的添加量为0.30 mL/g、絮凝时间为1.9 h、温度为31℃。按照此条件进行验证试验，得到溶液的澄清率为96.01%，溶液中甜菊糖的保留率为93.61%。

图8 分别为Y（澄清率）=f（A，B）响应面立体分析图（a）、Y（澄清率）=f（A，C）响应面立体分析图（b）、Y（澄清率）=f（B，C）响应面立体分析图（c）Fig.8 Response surface po Lt for the function Y（clarification rate）=f（A，B），Y（clarification rate）=f（A，C），Y（clarification rate）=f（B，C）

图9 分别为 Y（保留率）=f（A，B）响应面立体分析图（a）、Y（保留率）=f（B，C）响应面立体分析图（b）、Y（保留率）=f（A，C）响应面立体分析图（c）Fig.9 Response surface po Lt for the function Y（retention rate）=f（A，B），Y（retention rate）=f（B，C），Y（retention rate）=f（A，C）

3 结果与分析

本文在单因素试验的基础上，进行了响应面优化试验，确定壳聚糖作为絮凝剂时的条件为：第1、4次浸提液中，添加分子量为150 kDa的壳聚糖，添加量为0.3 mL1%壳聚糖溶液/g甜菊叶，48℃下絮凝2.9 h；得到溶液的澄清率为94.17%，溶液中甜菊糖的保留率为92.36%。第2、3次浸提液中，添加分子量为50 kDa的壳聚糖，添加量为0.3 mL1%壳聚糖溶液/g甜菊叶，31℃下絮凝1.9 h。得到溶液的澄清率为96.01%，溶液中甜菊糖的保留率为93.61%。

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Study on the Flocculation Process of Stevioside Extract

LI Xue1，LÜ Ai-di2，QIAO Chang-sheng1，2，*
（1.Tianjin Peiyang Biotrans Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；2.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

To optimize the flocculation of technology of water-extraction solution from stevia，the single factor tests and response surface methodology（RSM）were applied.Over all research was preceded by rational design.Technological condition parameters were determined according to regression analysis by SAS.The RSM was feasible for optimum flocculation process and this will improve flocculation effect.The conditions were as follows when chitosans were flocculating：added 0.3 mL/g chitosans whose molecular weight was 150 kDa into the first and the fourth extracts.The temperature was 48℃and the time was 2.9 h.Clarification rate and retention rate of the first and the fourth extracts was 94.17%and 92.36%.Added 0.3 mL/g chitosans whose molecular weight was 50 kDa into the second and the third extracts.The temperature was 31℃and the time was 1.9 h when chitosans were flocculating.Clarification rate and retention rate of the second and the third extracts was 96.01%and 93.61%.Using chitosan greatly reduces the production cost and the pollution to the environment.

stevioside；extration；flocculant；chitosans

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.013

天津市科技计划项目（14ZCZDNC00018）

李雪（1986—），女（汉），工程师，硕士研究生，主要从事生物技术应用与工程化研究。

*通信作者：乔长晟，男，教授，博士研究生。

2017-04-21