霍乱弧菌毒力基因zot的克隆表达及生物活性

， ，， ，

·论著·

霍乱弧菌毒力基因zot的克隆表达及生物活性

熊长辉，杨梦，刘晓青，王鹏，徐晓倩

目的对霍乱弧菌zot毒力基因进行表达并研究重组蛋白的生物活性。方法从霍乱弧菌(Vibrio cholerae)MO45中克隆zot的全基因序列，构建其原核表达质粒pET-32a(+)-zot并转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，通过诱导表达和亲和层析纯化重组蛋白，研究zot表达蛋白对人小肠上皮细胞的凋亡作用。结果纯化蛋白的浓度为0.324 mg/mL，经Western blot验证表达蛋白为目的蛋白，用流式细胞仪检测经表达蛋白作用的人小肠上皮细胞显示重组zot蛋白能引起人小肠上皮细胞的早期凋亡。结论成功克隆表达了霍乱弧菌毒力基因zot，重组蛋白能引起人小肠上皮细胞的早期凋亡。

霍乱弧菌；克隆表达；zot基因；人小肠上皮细胞

霍乱是由霍乱弧菌引起的急性水样便为主要特征的肠道传染病。由于仅有部分霍乱弧菌菌株可以引起霍乱流行，因此研究毒力基因分布和DNA分子特征，已成为目前学者们关注的重要课题[1]。霍乱毒力基因的分布特性为毒力因子产生水平转移提供了环境毒力贮存库，成为霍乱持续流行的重要因素[2]。外环境中大多数非致病性霍乱弧菌，经过复杂的进化和变异，某些特定的菌株可通过获得毒力而有效定植在人类小肠并释放肠毒素致病，其过程涉及多个毒力因子的协调作用[3-4]。在一定条件下，非流行株和非产毒株同样可以感染人体引起腹泻[5]。近年来发现，一些 O1/O139 群霍乱弧菌非产毒株也可以引起霍乱样腹泻[6]。zot毒力基因是检测霍乱弧菌毒力强弱的第2个指标，其编码的毒素增加肠黏膜通透性以及细胞间结构的耦合，本研究对霍乱弧菌zot毒力基因进行表达并研究表达蛋白对人小肠上皮细胞的作用。

1 材料与方法

1.1细胞株、菌株、质粒 人小肠粘膜上皮细胞(HUM-CELL-0032)，购自武汉原生原代生物医药科技有限公司；TOP10，BL21(DE3),质粒(pET-32a(+)),购自Invitrogen Biotechnology公司；O139霍乱弧菌标准株(MO45)，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所国家重点实验室惠赠.

1.2试剂与培养基TaqDNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶BamH I、XhoI(TaKaRa，Japan)；细菌DNA提取试剂盒，琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒，质粒抽提试剂盒(OMEGA，USA)；鼠抗-His抗体，羊抗鼠lg-G/辣根过氧化物酶标记二抗(Santa Cruze, USA)；蛋白纯化Ni-IDA Resin(均购自南京凯基，中国)。

1.3主要仪器 高速低温离心机(德国eppendorf公司)、PCR 扩增仪(美国Bio-Rad公司)、自动凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、电泳仪(中国上海天能科技有限公司TANONEPS-100)、超净工作台(中国苏净安泰SW-CJ-2FD)、培养箱(日本EYELA SLI-1200)、高速冷冻离心机(德国SIGMA 3-18K)、生物安全柜(美国Thermo公司)、Olympus IS71倒置荧光显微镜(日本Olympus)、流式细胞分析仪(美国BD FASCALBAR)、核酸/蛋白分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1引物设计与合成 根据NCBI数据库公布的霍乱弧菌标株N16961(GenBank/NC_002505.1)的基因全长序列用Primer Primier 5软件设计引物，其中，根据pET-32(a+)质粒图谱序列的酶切图谱，于引物的5′端分别加入BamH I(CGGGATCC)、XhoI(CCGCTCGAG)酶切位点和相应的保护碱基。引物如下：zotsense primer： 5′-CGGGATCCATGAGTATCTTTATTCATCAC-3′； zot Anti-sense primer： 5′-CCGCTCGAGTCAAAAT-ATACTATTTAGTCCTTTTTTATC-3′。

1.4.2MO45霍乱弧菌基因组DNA的提取 将霍乱弧菌MO45接种于LB肉汤，37 ℃，170 r/min培养至对数生长期，取1 mL菌液加入1.5 mL 离心管，5 000 r/min 10 min，弃上清后用细菌DNA提取试剂盒提取总DNA(方法参考OMEGA公司生产细菌DNA提取试剂盒说明书)。

1.4.3zot基因PCR扩增PCR反应体系为：10×Buffer 2.5 μL；dNTPs (每种dNTP溶液浓度为2.5 mmoL/ L) 2 μL；引物每条1 μL (终浓度1 μmol/L)；Taq酶0.5 μL (5 U/μL)；超纯水16 μL；模板2 μL，总反应体积为 25.0 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min，变性模板DNA；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.4zot基因的克隆 纯化后的zot基因PCR 扩增产物与载体pET32a(+) 用BamH I和XhoI进行双酶切，双酶切后的zot基因及载体pET32a(+)按摩尔比2∶1加入连接反应体系，T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜，转化预先制备的感受态细胞大肠杆菌TOP10，涂布含60 μg/mL Amp LB平板，同时将0.2mL感受态细胞涂布于不含Amp LB平板作为对照。倒置平板，37 ℃恒温培养箱中培养12～16 h，挑取单个白色菌落接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37 ℃，振荡培养160 r/min， 6～10 h，用于提取质粒鉴定。将构建的重组质粒命名为pET-32 a(+)-zot。

1.4.5 重组质粒的鉴定

1.4.5.1重组质粒的PCR鉴定 提取的重组质粒pET-32a(+)-zot为模板，用引物zotsense primer和zotAnti-sense primer进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.5.2重组质粒的酶切鉴定 对提取的重组克隆质粒pET-32a(+)-zot用限制性核酸内切酶BamH I和XhoI进行双酶切鉴定，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.5.3基因序列测定 将经双酶切检测阳性的重组质粒pET-32a(+)-zot送生工生物工程(上海)有限公司测序，采用通用引物T7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；T7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG进行测序。

1.4.6重组克隆质粒pET-32a(+)-zot的原核表达及表达结果分析 将重组质粒pET-32a(+)-zot转化预先制备的感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50 μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上，37 ℃培养过夜；从转化的LB平板上挑取重组菌落，接种于的LB液体培养基(50 μg/mL的卡那霉素)，同时接种宿主菌E.coliBL21(DE3)作为对照，37 ℃振荡(200 r/min)过夜培养；然后以50 μL转种于5 mL LB液体培养基(100 μg/mL Amp)，37 ℃振荡培养至浓度OD600为0.6～0.8时，向培养菌液中加入IPTG(终浓度0.5 mmol)，分别置于15 ℃、28 ℃、37 ℃诱导表达过夜，分别取1 mL培养物，12 000 r/min离心5min，去除上清液。在每管收集的菌体中加入60 μL 1×SDS，100 ℃煮沸10 min，14 000 r/min离心5 min，上清即为蛋白，收集蛋白于-20 ℃保存，并用SDS-PAGE分析表达产物。

1.4.7表达蛋白放大培养 培养1 L的表达菌，生长至OD600=0.8时，加终浓度0.5 mmol IPTG，15 ℃诱导16 h后收集菌体，用亲和层析柱(Ni-IDA Resin)纯化表达蛋白(整个纯化过程在低温下操作，方法按南京凯基公司生产蛋白纯化Ni-IDA Resin说明书操作)。

1.4.8蛋白浓度测定 吸取2 μL重组蛋白于核酸/蛋白分析仪测定其浓度。

1.4.9蛋白复性 经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的洗脱液进行蛋白复性，并加DTT至终浓度为5 mmol后放入到处理后的透析袋中，4 ℃环境下，透析到缓冲液中进行复性，每隔1.5 h换液一次，共9 h。然后用截留分子量为10 kDa的浓缩管浓缩，浓缩结束后，离心，取上清用0.22 μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80 ℃，同时做Western blot鉴定表达蛋白。

1.4.10表达蛋白对人小肠上皮细胞的凋亡作用 待细胞在培养板底部形成完整的类似上皮样的膜状结构时用于试验，使用前细胞用Hank’s缓冲液洗3次，再向每孔加入1mLDMEM，分别向12孔板中加入10 μg(30.86 μL)、20 μg (61.73 μL)、40 μg(123.46 μL)、80 μg (246.91 μL) 表达蛋白，空白孔加入等量PBS进行对照。重复1板。置37 ℃，5%的CO2培养箱中培养6h后用流式细胞仪观察并检测细胞凋亡情况。

2 结 果

2.1 质粒pET-32(a+)-zot的构建

2.1.1zot全基因PCR扩增 用Primer Premier 5自行设计合成的特异性引物对从霍乱弧菌M045提取总DNA进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳，得到与预计长度1 200bp一致的PCR产物(图1)。

2.1.2重组质粒的酶切分析 重组质粒经BamHI和XhoI双酶切后，产生两条带：一条为pET-32(a+)质粒带，另外一条约为1 200bp的zot带(图2)。初步说明zot基因已插入质粒pET-32(a+)载体。

图1 zot基因扩增图Fig.1 Amplification of zot gene

图2 重组质粒pET-32(a+)-zot双酶切Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid

2.1.3pET-32(a+)-zot基因测序 以pET-32(a+)载体测序通用引物T7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；T7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG对重组质粒测序，采用Blast程序将测序所得序列与模板序列的zot序列比对。结果显示，各连接点正确，插入序列与模板序列完全相符，命名为：pET-32 a (+)-zot。

2.2 重组蛋白的表达与鉴定

2.2.1SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果 取15 ℃、28 ℃、37 ℃诱导表达过夜的菌液各1 mL制样，SDS-PAGE分析结果(如图3)显示15 ℃为最佳表达温度。

M: Standard protein marker; 1: Uninduced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3); 2-4: Induced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3); 2: incubated at 15 ℃; 3: incubated at 28 ℃; 4: incubated at 37 ℃图3 SDS-PAGE 分析zot蛋白于BL21(DE3)表达情况Fig.3 Expression of zot fusion protein

2.2.2 亲和层析柱纯化表达蛋白

2.2.2.1上清通过亲和层析纯化表达蛋白SDS-PAGE分析 全菌采用超声裂解后，超速离心分离，取上清用亲和层析柱(Ni-IDA Resin)纯化目标蛋白，收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。电泳结果显示(图4)：上清中无明显目标蛋白。

M: SDS-PAGE Protein marker; 1: Whole cell bacteria break precipitated by centrifugation; 2: Whole cell supernatants after centrifugation bacteria break; 3: Supernatant and Ni-IDA effluent; 4-8: Eluent with different chromatography column图4 SDS-PAGE 分析zot蛋白上清纯化结果Fig.4 zot protein purified from supernatant were analyzed by SDS-PAGE

2.2.2.2包涵体通过亲和层析纯化表达蛋白SDS-PAGE分析 取诱导表达后的菌液用1×PBS洗涤，用Buffer B(8M Urea缓冲液)溶解菌体。超速离心后取上清用亲和层析柱(Ni-IDA Resin)纯化目标蛋白，收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。电泳结果显示(图5)：目标蛋白能与Ni-IDA很好的结合，收集Lane3-5复性。

2.3蛋白浓度测定 用核酸/蛋白分析仪测定纯化的重组蛋白浓度为0.324 mg/mL。

2.4Western blot分析重组蛋白 重组蛋白经SDS-PAGE分离后电泳转移至PVDF膜，以鼠抗His-tag抗体为一抗，羊抗鼠lg-G/辣根过氧化物酶为二抗进行Western blot分析。结果显示在zot重组蛋白预期大小处 (约48.0kD)有一条明显的特异性免疫反应条带 (图6)。

M: SDS-PAGE Protein marker; 1: The supernatant after centrifugation was dissolved 8M urea; 2: 8M urea were dissolved supernatant and Ni-IDA column effluent; 3-5: Eluent with different chromatography column图5 SDS-PAGE 分析zot蛋白包涵体纯化结果Fig.5 zot protein purified from inclusion bodies were analyzed by SDS-PAGE

M: Prestained protein molecular weight marker; 1: Induced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3)图6 表达产物的免疫印迹分析Fig.6 Western blot analysis of expression products

2.5重组蛋白对人小肠上皮细胞的凋亡作用 在培养人小肠上皮细胞的过程中，经流式细胞仪测定，随着重组蛋白浓度的增加，人小肠上皮细胞的早期凋亡率升高(如表1)。

表1 重组表达蛋白对人小肠上皮细胞的作用
Tab.1 The role of recombinant expression protein in human intestinal epithelial cells

蛋白浓度(μg/mL)proteinconcentration(μg/mL)细胞比例(%)cellproportion(%)正常细胞normalcells死亡细胞dyingcells早期凋亡细胞viableapoptoticcell晚期凋亡细胞non⁃viableapoptoticcell1087．600．1211．171．112080．840．9015．522．744076．501．0619．802．648071．081．0324．163．73PBS对照94．602．122．171．11

3 讨 论

霍乱是由O1和O139群霍乱弧菌引起的以急性腹泻为特征的肠道传染病，霍乱弧菌主要通过肠毒素致病，霍乱弧菌在通过胃到达小肠后，粘附于小肠粘膜表面，在肠腔的碱性环境下迅速繁殖并产生霍乱毒素，毒素作用于小肠粘膜，引起肠液的大量分泌。zot基因存在于霍乱弧菌中对霍乱的致泻起辅助作用，该基因由溶源性噬菌体CTXΦ编码[7]。对zot亚细胞定位的研究发现[8-9]，zot蛋白定位于霍乱弧菌的细胞外膜上，为相对分子质量大约为48 kD的一条单肽链。Uzzau还推测，zot的N-末端部分与CTXΦ的形态形成有关，而C-末端区域可能与zot的毒素活性有关[8-9]。Waldor等[7]认为，zot发生突变时CTXΦ遗传因子不能正确自我传递，因此推测zot基因产物为CTXΦ复制所必需。临床上也认为ctxAB基因与zot基因总是共存，提出zot可能与引起严重腹泻的霍乱菌株高致病力有密切关系[10]。

近些年，研究者对细菌诱导宿主细胞凋亡的机理进行了大量研究发现，细胞凋亡主要与致病菌的毒力因子有关。细菌与宿主机体相互作用的关系非常复杂，1992年首次发现细菌可以引起受感染的宿主细胞发生凋亡，细胞凋亡研究开始涉足细菌感染领域[11]。目前对于zot基因研究还有些争论，zot基因被报道参与多种疾病的发生和发展[12]。以前认为zot基因编码的毒素对霍乱的致泻起辅助作用，zot毒力基因与霍乱肠毒素ctxAB能够激发完整的细胞毒性效应[13-16]，然而zot毒力基因的毒力机制以及对人小肠上皮细胞的作用机制还未见报道，所以本文构建zot原核表达质粒pET-32a(+)-zot并转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，通过诱导表达和亲和层析纯化重组蛋白，研究zot表达蛋白对人小肠上皮细胞的凋亡作用。通过本研究发现zot表达蛋白能够引起人小肠上皮细胞的早期凋亡，随着蛋白浓度的增大人小肠上皮细胞的早期凋亡程度也增大，细胞膜的通透性也增大。利用分子生物学技术研究霍乱弧菌zot毒力基因的毒力强弱及细胞表达水平，为研究菌株的毒力强弱、致病机制及引起流行的潜力，以及更深入地研究霍乱弧菌的基因组特征提供依据，为研发抗霍乱感染的安全性疫苗提供进一步指导，为江西省霍乱的流行趋势及防控策略提供科学依据。

[1] Mantri CK, Mohapatra SS, Colwell RR, et al. Sequence analysis ofVibriocholeraeorfU and zot from pre-CTXΦ and CTXΦ reveal smultiple origin of pre-CTXΦ and CTXΦ[J]. Environmental Microbiol Reports, 2010, 2(1): 67-75.DOI: 10.1111/j.1758-2229.2009.00085.x

[2] Eisenstein BI. The polymerase chain reaction: a new method of using molecular genetics for medical diagnosis[J]. N Engl J Med, 1990, 322(3): 178-183. DOI:10.1056/NEJM199001183220307

[3] Duan GC, Gao SY, Liu YQ, et al. Study on rapid detection ofVibriocholeraewith polymerase chain reaction[J]. Chin J Microbiol Immunol, 1994, 14(6): 376-379. (in Chinese)

段广才,高守一,刘延清,等.霍乱弧菌PCR快速检测及应用研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,1994,14(6):376-379.

[4] Olsvik O, Wahlberg J, Petterson B, et al.Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B inVibriocholeraeO1-strains[J]. J Clin Microbiol, 1993, 31(1): 22-25.

[5] Rui YY, Xu RH, Kan B, et al. Sequence analysis of important toxic genes and housekeeping genes ofVibriocholeraestrains isolated from Guangdong province[J].Chin J Public Hlth, 2006, 22(1): 31-33. (in Chinese)

芮勇宇,许锐恒,阚飙,等.霍乱弧菌主要毒力基因和管家基因序列分析[J].中国公共卫生,2006,22(l):31-33.

[6] Rui YY, Kan B, Liu P, et al. Sequence analysis of toxin coregulated pilus gene ofVibriocholeraestrains isolated from China[J]. Chin J Lab Med, 2006, 29(4): 358-361. (in Chinese)

芮勇宇, 阚飙,刘朋,等.我国霍乱弧菌毒力协同调节菌毛基因序列分析[J].中华检验医学杂志,2006,29(4):358-361.

[7] Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous bacteriophage encoding cholera toxin[J]. Science, 1996, 272: 1910-1914.

[8] Di Pierro M,Lu R,Uzzau S, et al. Zonula occludens toxin structure-function analysis: Identification of the fragment biologically active on tight junctions and of the zonulin recept or binding domain[J]. Biol Chem, 2001, 276 (22): 19160-19165.DOI:10.1074/jbc.M009674200

[9] Uaasu S, Cappuccinelli P, Fasano A. Expression ofVibriocholeraezonula occludens toxin and analysis of its subcellular localization[J]. Microbial Pathogenesis, 1999, 27(3): 377-385.DOI:10.1006/mpat.1999.0312

[10] Faruque SM, Chowdhury N, Kamruzzaman M, et al. Genetic diversity and virulence potential of environmentalVibriocholeraepopulation in a cholera-endemic area[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(7): 2123-2128.DOI: 10.1073/pnas.0308485100

[11] Lancellotti M, Pereira RF, Cury G, et al. Pathogenic and opportunistic respiratory bacteria induced apoptosis[J]. Braz J Infect Dis, 2009, 13(3): 226-231.

[12] Mahendran V, Tan YS, Riordan SM, et al. The prevalence and polymorphisms of zonula occluden toxin gene in multipleCampylobacterconcisusstrains isolated from saliva of patients with inflammatory bowel disease and controls[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e75525.DOI:10.1371/journal.pone.0075525

[13] Rashid MU, Rashed SM, Islam T, et al. CtxB1 outcompetes CtxB7 inVibriocholeraeO1[J]. J Med Microbiol, 2016, 65(1): 101-103.DOI:10.1099/jmm.0.000190

[14] Phongsisay V, Iizasa E, Hara H, et al. Evidence for TLR4 and FcRγ-CARD9 activation by cholera toxin B subunit and its direct bindings to TREM2 and LMIR5 receptors[J]. Mol Immunol, 2015, 66(2): 463-471.DOI:10.1016/j.molimm.2015.05.008

[15] Telesmanich NR, Koliakina AV, Lomov IM, et al. Characterization of the adhesive activity of cholera vibrions in mammalian red blood cells as an additional test for assessment of their epidemic significance[J]. Klin Lab Diagn, 2008, (7): 45-48.

[16] Baldauf KJ, Royal JM, Hamorsky KT, et al. Cholera toxin B: one subunit with many pharmaceutical applications[J]. Toxins (Basel), 2015, 7(3): 974-996. DOI:10.3390/toxins7030974

CloningandexpressionofzotgeneofVibriocholeraeanditsbiologicalactivity

XIONG Chang-hui, YANG Meng, LIU Xiao-qing, WANG Peng, XU Xiao-qian

(DepartmentofInfectiousDiseases，JiangxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

The aim of this study is to construct the expression vector ofzotgene ofVibriocholeraeand to realize the expression ofzotgene ofVibriocholeraeinE.coliand study the biological activity of its recombinant expression product. In order to expresszotprotein inE.coli, the full-length open reading frame ofzotwas amplified by PCR from the standard strains ofVibriocholeraeMO45 genome DNA. The PCR product was cloned into prokaryotic expression vector pET-32a(+) with restriction enaymesBamH I andXhoI. The recombinant vector pET-32a(+)-zotwas transformed intoE.coliBL21 (DE3) and expressed by IPTG induction. Thezotfusion protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting and purified by Ni-NTA affinity chromatography. After expression and purification, the recombinant expression protein played as a target for human small intestinal epithelial cells. Restriction endonuclease digestion, PCR and DNA sequencing analysis showed that thezotgene of 1 200 bp was amplified fromVibriocholeraeDNA, and the recombinant plasmid pET-32a(+)-zotwas constructed and detected its expression in prokaryotic cell successfully with SDS-PAGE and Western blot techniques. Thezotrecombinant protein was successfully expressed and purified. The purifiedzotrecombinant protein can cause human intestinal epithelial cells apoptosis.

Vibriocholerae;zotgene; cloning and expression; human intestinal epithelial cell

Xu Xiao-qian, Email: xch526@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.009

江西省科技厅项目基金(No.20151BBG70106)

徐晓倩，Email:xch526@163.com

江西省疾病预防控制中心传染病所，南昌 330029

R378.3

A

1002-2694(2017)11-0996-06

Supported by the Science and Technology Program of Science and Technology Department of Jiangxi Province(No.20151BBG70106)

2017-02-17编辑梁小洁