模拟外周静脉PICC置管联合5-FU对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响

赵艳杰，王彦茹，吴兰华，陈玲，赖丽君，林素兰

(新疆医科大学，乌鲁木齐830000)

模拟外周静脉PICC置管联合5-FU对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响

赵艳杰，王彦茹，吴兰华，陈玲，赖丽君，林素兰

(新疆医科大学，乌鲁木齐830000)

目的观察模拟外周静脉置入中心静脉导管(PICC)置管联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响，探讨其损伤静脉内皮细胞的机制。方法将体外培养2～3代的人脐静脉内皮细胞随机分成对照组、PICC损伤组、5-FU损伤组、联合损伤组，对照组加入完全培养基，PICC损伤组模拟PICC置管损伤(把PICC导管切成小段，用消毒枪头对贴壁细胞进行划痕，与细胞一起培养)，5-FU损伤组模拟5-FU外渗损伤(将5-FU配制成4 μL/mL溶液，与细胞一起培养)，联合损伤组模拟PICC置管损伤+5-FU外渗损伤。培养0、5、10、30、60、120 min后，观察各组细胞形态变化，采用MTT比色法检测细胞增殖活性，ELISA法检测血管性假性血友病因子(vWF)表达水平；细胞划痕法诱导24 h后，观察各组细胞迁移能力。结果镜下观察对照组细胞形态为不规则的梭形，胞质饱满、排列紧密，各模拟组细胞形态均有不同程度的收缩、变圆、胞质皱缩，细胞脱落，模拟PICC置管损伤组细胞形态改变最轻，模拟PICC置管联合5-FU损伤组最为显著。与对照组比较，各模拟组细胞活性降低、细胞迁移能力降低，模拟PICC置管联合5-FU损伤组细胞活性、细胞迁移能力较其他各组均降低(P均<0.05)。各模拟组培养30 min后细胞培养上清液中vWF水平均明显升高，模拟PICC置管联合5-FU损伤组vWF水平较其他各组均升高(P均<0.05)。结论PICC置管联合5-FU能够损伤人脐静脉内皮细胞，降低细胞增殖活性，抑制细胞迁移；该作用可能与其刺激细胞产生vWF有关。

中心静脉导管；5-氟尿嘧啶；人脐静脉内皮细胞；血管性假性血友病因子；细胞增殖；细胞迁移；体外实验

目前，经外周静脉置入中心静脉导管(PICC)已广泛用于长期静脉输液、反复输入血制品、静脉高营养、化疗等患者。PICC在为临床治疗提供方便的同时，因反复置管、长期留置和护理不当等，会对患者的静脉血管壁造成机械性刺激[1]，再加上化疗药物外渗，对血管造成严重损伤，常导致静脉血栓、静脉炎等相关并发症[2，3]。既往研究[4]表明，导管留置时间、血管损伤、内皮细胞凋亡三者呈正相关。血管内皮细胞是构成血管内膜层的主要成分，它能通过合成和释放多种血管活性因子，在血管的病理、生理中发挥重要作用[5]。血管性假性血友病因子(vWF)是鉴定内皮细胞受到刺激或损伤的特异性标志物，其表达量可反映内皮细胞损伤程度[6]。研究显示，PICC置管、5-氟尿嘧啶(5-FU)外渗会对血管造成严重损伤，但其机制尚不明确，而内皮细胞的病理生理功能又是血管损伤修复的第一步。2017年1～6月，我们通过体外培养人脐静脉内皮细胞，观察PICC置管联合5-FU对细胞活力、细胞迁移能力及细胞培养上清液中vWF表达水平的影响，探讨PICC、5-FU导致血管损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞EA.HY926细胞株购于上海拜力生物科技有限公司，高糖培养基(DMEM)、双抗、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司。胎牛血清购自美国Gibco公司。PICC导管购自美国巴德公司。5-FU购自上海旭东海普药业有限公司。96孔板购自美国康宁公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。CO2培养箱、酶标仪购自奥地利SUNEISE。

1.2 细胞培养与分组处理 将细胞用含有10%胎牛血清、5%双抗与DMEM的完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长到80%～90%融合时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代，取2～3代用于实验。把PICC导管切割成均匀的1 mm小段，用10 μL消毒枪头对贴壁细胞进行划痕，与细胞一起培养来模拟PICC置管对血管的损伤。按人体表面积给药，将5-FU配制成4 μL/mL溶液，与细胞一起培养来模拟药物外渗对血管的损伤。将细胞分为4组，对照组加入完全培养基，PICC损伤组模拟PICC置管损伤，5-FU损伤组模拟5-FU外渗损伤，联合损伤组模拟PICC置管损伤+5-FU外渗损伤。

1.3 细胞增殖活性观察 采用MTT比色法。将EA.HY926细胞制成单细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板。继续培养24 h，使细胞同步化，洗去未贴壁的细胞。将细胞分为4组，处理方法按1.2，每组设6个复孔。培养0、5、10、30、60、120 min后，加入5 g/L MTT 10 μL继续培养4 h，小心吸除并保留原培养液，用于vWF检测。再在各孔中加入150 μL DMSO，置于酶联免疫检测仪内，于490 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值。通过OD值比较各模拟组与对照组细胞增殖活性的变化。

1.4 细胞迁移能力观察 采用划痕法。将EA.HY926细胞制成单细胞悬液，按2 mL/孔接种于6孔板。待细胞长满后，取消毒的200 μL枪头，垂直进行细胞划痕。PBS洗涤3次，去除划下的细胞。将细胞分为4组，处理方法按1.2。继续培养24 h后，用显微镜拍摄24 h时的细胞划痕图像(50×)，用IPP软件计算细胞迁移率。

1.5 细胞培养上清液中vWF检测 取4组细胞培养上清液，用0.22 μm针式滤器抽滤，按照ELISA试剂盒说明书检测vWF水平。

2 结果

2.1 各组细胞形态学比较 倒置相差显微镜下可见，对照组细胞呈不规则的梭形，细胞核呈椭圆或圆形，偶见双核，胞质饱满丰富，细胞边界清楚，细胞较多、密集，单层融合时呈典型的“铺路石”样。PICC损伤组多数细胞胞质饱满丰富，少数细胞收缩、变圆，细胞边界不清楚，间隙增宽，较少有细胞脱落。5-FU损伤组多数细胞胞质不甚饱满且不丰富，细胞收缩、变圆，细胞边界不清楚，间隙增宽，有较多细胞脱落。联合损伤组较多细胞胞质空瘪贫乏，细胞收缩、变圆，细胞边界不清楚，间隙增宽，随处可见细胞脱落。

2.2 各组细胞增殖活性比较 与对照组相比，PICC损伤组、5-FU损伤组、联合损伤组培养30、60、120 min后OD值减少(P均<0.05)，联合损伤组OD值最低(P均<0.05)。见表1。

表1 各组不同时点细胞增殖活性比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

2.3 各组细胞迁移能力比较 PICC损伤组、5-FU损伤组、联合损伤组、对照组的细胞迁移率分别为51.72%、21.57%、18.24%、75.94%，PICC损伤组、5-FU损伤组、联合损伤组细胞迁移率均较对照组下降(P均<0.05)，其中联合损伤组细胞迁移率最低(P均<0.05)。

2.4 各组细胞培养上清液中vWF水平比较 诱导30 min时，PICC损伤组、5-FU损伤组、联合损伤组细胞培养上清液vWF水平均高于对照组，并达到峰值(P均<0.05)；在5、10、60、120 min时各组细胞培养上清液vWF水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组不同时点细胞培养上清液中vWF水平比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

3 讨论

PICC是由硅胶材料制成、标有刻度、可放射显影富有高弹性的输液导管，常用于需要持续输液、反复输入血液制品、静脉给予高营养、化疗等患者[7]。PICC在为临床提供方便、优质治疗的同时，也产生了诸多并发症，如静脉炎、静脉血栓等，增加了患者的痛苦甚至病死率[8]。5-FU属于化学制剂类广谱抗肿瘤药物，其不良反应较明显[9]，静脉输注时一旦药物发生外渗可造成局部软组织、血管的炎症反应，使组织和血管损伤、溃烂，甚至导致功能障碍[10]。另外，成纤维细胞也受到损伤，使组织修复困难，加上炎性细胞产生的抑制作用，最终导致坏死的局部组织迁延不愈[11]。

静脉血栓、静脉炎是临床静脉输液导管引起的常见并发症[12]。这些并发症主要是由导管的机械性刺激和外渗药物的毒性引起。引起内皮损伤或功能障碍的病理刺激有两种，一种是血流或置入物对内皮层产生的剪切力、压力等机械力，另一种是由细菌内毒素、炎症因子等引起的生化改变。PICC反复置入和外渗5-FU药物的刺激对内皮细胞损伤的病理机制分别属于第一、第二种。PICC、5-FU可导致血管内皮细胞多种形式的功能失调，如形态的改变、血管内皮细胞增殖和迁移的抑制等，最终导致血管病变的发生。本研究结果显示，各模拟组细胞生长较慢，数量较少，单层融合时并没有出现典型的“铺路石”样，说明PICC、5-FU对EA.HY926细胞造成了损伤。MTT检测显示，同一组不同时间点测定的OD值减少，30、60、120 min时OD值与对照组比较有统计学差异，表明细胞的活性开始降低，30 min时PICC、5-FU对EA.HY926细胞造成了损伤；而30、60、120 min时，各模拟组间OD值比较差异无统计学意义，说明EA.HY926细胞并没有随着诱导时间的延长而加重损伤，这与既往研究血管内皮损伤呈时间依赖性相悖，可能与本实验导管留置时间间隔较短有关。而当PICC导管联合5-FU共同培养EA.HY926细胞时，同一时间点测得的OD值显著低于对照组；在细胞划痕实验中，当PICC导管联合5-FU共同培养EA.HY926细胞时，细胞迁移率最低。说明PICC导管联合5-FU使EA.HY926细胞功能失调，会抑制EA.HY926细胞的增殖和迁移，使其形态改变和功能异常，导致细胞损伤和细胞凋亡，进而使静脉血管发生病变。PICC导管作为异物置入血管，由于机械性刺激和留置会对EA.HY926细胞造成不同程度的损伤。5-FU主要通过其毒性作用于细胞代谢周期的各个阶段，通过影响细胞DNA和蛋白质的合成[13]，引起严重的慢性组织反应、坏死。

既往研究表明，血管壁内皮细胞的损伤修复在血管壁的病理生理中有重要作用[14]。内皮细胞在受到刺激或损伤时，Weibel-Palade小体释放出vWF，vWF介导血小板聚集于损伤的血管内皮下，启动血栓引起血管并发症。有研究发现，在受到损伤或刺激的内皮细胞的溶解物及上清中，vWF的合成和释放均增加。本研究结果显示，各模拟组EA.HY926细胞培养上清液中vWF水平与对照组相比均有不同程度的升高，其中以联合损伤组升高最为明显，并在30 min时达到峰值，随后下降并趋于平稳，说明EA.HY926细胞在受到PICC、5-FU引起的损伤后，细胞Weibel-Palade小体快速释放vWF参与炎症反应，同时可推断PICC、5-FU是通过vWF造成EA.HY926细胞损伤。

综上所述，模拟PICC置管联合5-FU对内皮细胞造成了损伤，表现为影响细胞形态和对其生物功能的抑制，其机制可能与Weibel-Palade小体释放vWF造成细胞损伤有关。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.013

R47

A

1002-266X(2017)42-0046-03

新疆维吾尔族自治区自然科学基金资助项目(2016D01C175)。

林素兰(E-mail: 2402745049@qq.com)

2017-07-28)