冬凌草甲素对人脑胶质瘤细胞株U251杀伤、增殖及NF-κB蛋白表达的影响

苑鹤毅，王丽敏，刘君，林大勇，刘鸿，白剑,4，张丽艳

(1辽宁中医药大学实验动物中心， 沈阳110847；2 辽宁中医药大学附属医院；3 辽宁省中医药研究院临床药理室；4中国人民解放军第三〇九医院器官移植研究所)

冬凌草甲素对人脑胶质瘤细胞株U251杀伤、增殖及NF-κB蛋白表达的影响

苑鹤毅1，王丽敏2，刘君3，林大勇1，刘鸿1，白剑1,4，张丽艳1

(1辽宁中医药大学实验动物中心， 沈阳110847；2 辽宁中医药大学附属医院；3 辽宁省中医药研究院临床药理室；4中国人民解放军第三〇九医院器官移植研究所)

目的观察冬凌草甲素对人脑胶质瘤细胞株U251杀伤、增殖及NF-κB蛋白表达的影响。方法将浓度为10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素与U251细胞(实验组)分别孵育，同时设不加冬凌草甲素培养的U251细胞作对照组，分别于不同时间点计数U251、计算冬凌草甲素对U251细胞的IC50、测算U251细胞增殖抑制率、检测U251细胞中的NF-κB蛋白。结果与对照组相比，实验组加入40 、80 μmol /L的冬凌草甲素后U251细胞数明显减少(P均lt;0.05)。冬凌草甲素作用24、48 、72 h时对U251细胞的IC50分别为82.2、65.3、44.1 μmol /L。与20 μmol /L冬凌草甲素相比，40、80 μmol /L冬凌草甲素作用48、72 h时的细胞增殖抑制率明显降低(P均lt;0.05)。与对照组相比，40、80 μmol /L的冬凌草甲素作用48、 72 h时，U251细胞中NF-κB蛋白的相对表达量明显降低(P均lt;0.05)。结论冬凌草甲素在体外可杀伤人脑胶质瘤细胞株U251，抑制其增殖，下调其NF-κB蛋白的表达；冬凌草甲素对U251细胞的杀伤、增殖抑制作用可与其对NF-κB信号通路发挥调节作用有关。

冬凌草甲素；脑胶质瘤；细胞生长；细胞增殖；NF-κB信号通路；NF-κB蛋白

人脑胶质瘤是颅内常见的侵袭性肿瘤之一，呈浸润生长，与周围脑组织界限不清，恶性度高，手术切除后易复发，患者发病后存活期短、病死率高，平均存活时间1.5 a[1，2]。在对切除的人脑胶质瘤组织进行病理检查过程中发现NF-κB信号通路的异常活化在脑胶质瘤的发生和发展过程中发挥了重要作用[3，4]。冬凌草甲素为唇形科香茶菜属植物冬凌草干燥品的提取物，其主要成分为以贝壳杉烯为骨架的四环二萜类化合物[5]。有研究[6]发现，冬凌草甲素在体内和体外对人源性和动物源性肿瘤细胞的生长均具有明显抑制作用，其作用机制与抑制NF-κB蛋白表达有关。2016年10月1日～2017年4月30日，我们观察了不同浓度的冬凌草甲素对人脑胶质瘤细胞株U251杀伤、增殖及NF-κB蛋白表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药品、细胞及试剂 冬凌草甲素纯品购自上海诗丹德生物技术有限公司。人脑胶质瘤细胞株U251购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司。RPMI1640培养液购自美国Gene公司；Hyclone小牛血清购自美国Thermo scientific公司； NF-κB(p-P65)和α-Tublin抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；二抗购自中杉金桥公司；MTT、台盼蓝和1.25%胰酶购自美国Sigma-Aldrich公司；其余分析纯试剂购自国药集团辽宁分公司。

1.2 冬凌草甲素对U251细胞的杀伤情况观察及IC50计算 将处于对数生长期的U251细胞消化后接种于96 孔板，并对细胞进行计数，每孔细胞数为1 ×104个，待细胞贴壁后，实验组分别在每孔加入含10、20、40 、80 μmol /L冬凌草甲素的无血清培养基，每个浓度设5个复孔，对照组加入不含冬凌草甲素的无血清培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养并在第24、48、72 h时分别用1.25%的胰酶消化，台盼蓝染色并对每孔内的细胞进行计数，以5个复孔细胞数的平均值绘制生长曲线，计算24、48 、72 h 时冬凌草甲素对U251细胞的IC50。

1.3 冬凌草甲素对U251细胞增殖的影响观察 将处于对数生长期的U251细胞消化后接种于96 孔板，并对细胞进行计数，每孔细胞数为1 ×104个，待细胞贴壁后，实验组分别于每孔加入含10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素的无血清培养基，每个浓度设5个复孔，对照组加入不含冬凌草甲素的无血清培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24、48、72 h。在MTT实验前用PBS清洗2次，加入5 mg /mL的MTT 20 μL并继续培养4 h，弃去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，并置摇床15 min。调整酶标仪波长至 490 nm处，测算光密度值(OD值)，并计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率= [(对照组OD值-实验组OD值) /对照组OD值]×100%。

1.4 冬凌草甲素对U251细胞NF-κB蛋白表达的影响观察 将处于对数生长期的U251细胞消化后接种于6孔板，实验组分别加入10、20、40、80 μmol/L的冬凌草甲素，对照组不加冬凌草甲素，分别于培养48、72 h时收集部分细胞，用蛋白裂解液裂解后收集到1.5 mL的 EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min离心1 min，弃上清备检。BCA法进行NF-κB蛋白定量检测：向SDS-PAGE凝胶中加入样本，电泳分离后电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加入NF-κB(1∶1 000)和α-Tublin(1∶1 000)抗体4 ℃孵育过夜后，加入二抗37 ℃孵育30 min。采用凝胶成像分析系统，通过各条带的灰度值计算NF-κB蛋白的相对表达量。

2 结果

2. 1 冬凌草甲素对U251细胞的杀伤情况及IC50各时间点实验组、对照组U251细胞计数比较见表1。由表1可见，实验组加入10、20μmol /L的冬凌草甲素后U251细胞数无明显变化，加入40 、80 μmol /L的冬凌草甲素后U251细胞数明显减少。冬凌草甲素作用24、48 、72 h时对U251细胞的IC50分别为82.2、65.3、44.1 μmol /L。

表1 各时间点实验组、对照组U251细胞计数比较(个

注：与对照组相比，*Plt;0.05。

2.2 冬凌草甲素对U251细胞增殖的影响 加入不同浓度冬凌草甲素的实验组各时间点U251细胞增殖抑制率见表2。由表2可见，10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素对U251细胞的增殖在不同的时间点上均有抑制作用；与20 μmol /L冬凌草甲素相比，40、80 μmol /L冬凌草甲素作用48、72 h时的细胞增殖抑制率明显降低(P均lt;0.05)。随着作用时间的延长，20、40、80 μmol /L冬凌草甲素对U251细胞的增殖抑制率依次降低(P均lt;0.05)。

表2 加入不同浓度冬凌草甲素的实验组各时间点U251细胞增殖抑制率

2.3 冬凌草甲素对U251细胞NF-κB蛋白表达的影响 培养48 、72 h时实验组和对照组U251细胞中的NF-κB蛋白相对表达量比较见表3。由表3可见，与对照组相比，不同浓度的冬凌草甲素作用U251细胞48 、72 h时，U251细胞中NF-κB蛋白的表达均下调；与对照组相比，40、80 μmol /L的冬凌草甲素作用48、 72 h时，U251细胞中NF-κB的相对表达量明显降低(P均lt;0.05)。

表3 培养48 、72 h时实验组和对照组U251细胞中的NF-κB蛋白相对表达量比较

注：与对照组相比，*Plt;0.05。

3 讨论

脑胶质瘤是颅内最常见也是致死率最高的恶性肿瘤，发病率约为十万分之五，患者5年生存率较低，仅为20%左右[1,7]。近年来的研究[7]证实，NF-κB信号通路在脑胶质瘤的生长、侵袭和转移相关基因的调节过程中发挥关键性作用。有研究[1,8]发现，在活化的星型胶质瘤细胞中和高级别的胶质瘤细胞中NF-κB表达增强，而在低级别的星型胶质瘤细胞中NF-κB的表达明显减弱，在正常脑组中NF-κB表达很弱甚至无法检出。如果能够有效抑制NF-κB通路就可以降低肿瘤的增殖速度，为临床治疗脑胶质瘤提供一条新的途径。

天然抗肿瘤药物是近年来中药药理研究的热点之一。有研究[9～12]发现，冬凌草甲素能够抑制不同组织来源的人源性肿瘤细胞的生长，其中包括肺癌细胞株A149、肝癌细胞株HepG-2、胃癌细胞株MKN45和膀胱癌细胞株MB49等，而且其不良反应低，对肝、肾、骨髓等多种器官均无明显损伤。冬凌草甲素能够通过多种途径发挥对肿瘤生长的抑制作用，可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、阻止肿瘤细胞从G1期进入S期、诱导肿瘤细胞发生自噬、调节细胞周期蛋白蛋D1的合成及抑制端粒酶活性等途径来发挥抗肿瘤作用[13]。目前认为冬凌草甲素发挥抗肿瘤作用的机制与调节Wnt信号通路、Caspase调控的凋亡信号通路及活化ATR通路和NF-κB通路有关[14]。

本研究发现浓度为40 μmol /L和80 μmol /L的冬凌草甲素在离体情况下对U251细胞作用48 h可对其生长发挥明显的抑制作用，并且这种抑制作用呈现一定的时间和剂量依赖性，作用72 h时对U251的抑制率可达50%以上。在经过浓度为40 μmol /L和80 μmol /L的冬凌草甲素孵育48 h后，U251细胞中NF-κB蛋白的相对表达量明显降低，孵育72 h后U251细胞中NF-κB蛋白的相对表达量进一步降低。这一研究结果显示，冬凌草甲素在体外可杀伤人脑胶质瘤细胞株U251，抑制其增殖，下调其NF-κB蛋白的表达。推测凌草甲素对U251细胞的杀伤、增殖抑制作用可能与其对NF-κB信号通路发挥调节作用有关，也进一步提示NF-κB蛋白对于调控肿瘤细胞的增殖发挥重要作用，如果能够有效抑制NF-κB蛋白的表达就能抑制脑胶质瘤细胞的生长。

综上所述，脑胶质瘤作为一种恶性的神经系统肿瘤一直是临床治疗的难点之一，冬凌草甲素有望作为NF-κB通路的抑制剂实现抑制脑胶质瘤生长的目的，由于其不良反应小，对肝、肾、骨髓等多种器官均无明显损伤，具有潜在临床应用价值。

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Effectsoforidoninonkilling,proliferation,andexpressionofNF-κBproteinofhumangliomaU251cellline

YUANHeyi1,WANGLimin,LIUJun,LINDayong,LIUHong,BAIJian,ZHANGLiyan

(1LaboratoryAnimalCenter,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Liaoning110847,China)

ObjectiveTo observe effects of oridonin on killing, proliferation, and expression of NF-κB protein of human glioma U251 cell line.MethodsU251 cells were incubated with oridonin at the concentrations of 10, 20, 40, and 80 μmol/L respectively. At the same time, U251 cells incubated without oridonin were taken as the control group. U251 counting, IC50, U251 cell proliferation inhibition rate and expression of NF-κB were detected at different time points.ResultsCompared with the control group, the number of U251 cells in the 40 and 80 μmol/L oridonin groups decreased significantly (Plt;0.05). After incubation for 24, 48 and 72 h, the IC50of U251 cells was 82.2, 65.3 and 44.1 μmol/L, respectively. Compared with 20 μmol/L oridonin group, the cell proliferation inhibition rates of the 40 and 80 μmol/L oridonin groups were significantly reduced at 48 and 72 h (Plt;0.05). Compared with the control group, the expression of NF-κB in U251 cells decreased significantly (Plt;0.05) in the 40 and 80 μmol/L oridonin group at 48 and 72 h.ConclusionsOridonin can kill U251 cells, inhibit its proliferation and down-regulate NF-κB protein in vitro. The killing effect and inhibition can be related to the regulation of NF-κB signaling pathway.

oridonin; glioma; cell growth; cell proliferation; NF-κB signaling pathway; NF-κB protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.005

R329.2

A

1002-266X(2017)43-0014-03

辽宁省自然科学基金资助项目(201602506)。

苑鹤毅(1986-)，女，学士，助理实验师，主要研究方向为抗肿瘤药物的机制研究。E-mail： 15342437@qq.com

张丽艳(1975-)，女，博士，副教授，主要研究方向为肿瘤的中药治疗。E-mail： 512367830@qq.com

2017-08-01)