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高效离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中的功能性低聚糖

2017-12-11宁啸骏杜茹芸

食品科学 2017年24期
关键词:低聚糖奶粉功能性

朱 伟,宁啸骏,杜茹芸

高效离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中的功能性低聚糖

朱 伟,宁啸骏,杜茹芸

(上海市质量监督检验技术研究院,上海 200233)

建立一种同时测定蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖的高效离子色谱检测技术,采用CarboPac PA20色谱柱分离,以氢氧化钠-乙酸钠为流动相,梯度洗脱,使用脉冲安培检测器进行检测。结果表明,在本实验条件下8 种功能性低聚糖得到了很好分离,回收率为80.0%~103%,相对标准偏差小于3%(n=6)。该方法能快速、准确、可靠地检测婴幼儿配方奶粉中功能性低聚糖的含量。

配方奶粉;功能性低聚糖;高效离子色谱;脉冲安培检测器

功能性低聚糖是指由2~10 个相同或不同的单糖,以糖苷键聚合而成的糖类,由于其不为人体胃酸、胃酶所降解,却能被人体肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌群选择性地利用,因此具有改善脂质代谢,降低血脂和胆固醇,促进钙、镁等矿物元素的吸收,提高免疫力等生理功能[1-4]。目前,功能性低聚糖如低聚果糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖,已经成为食品工业中应用最广泛的健康食品配料之一,不仅可应用于饮料[5-6]、乳制品[7-8]、酒类、保健食品[9-10],还可应用于婴幼儿食品中[11-13]。研究发现,添加了功能性低聚糖的婴幼儿奶粉能促进婴幼儿肠道有益菌群生长,抑制有害菌,增强婴幼儿的免疫力,提高肠道的防御功能,预防婴幼儿感染性腹泻;另外,还可以通过促进婴幼儿肠道蠕动,帮助形成软便,从而改善婴幼儿的功能性便秘[14-19]。

GB 14880—2012《食品营养强化剂使用标准》规定低聚果糖、棉子糖等功能性糖类物质可以作为营养强化剂应用于婴幼儿配方食品和婴幼儿谷类辅助食品中,该类物质总量不超过64.5 g/kg。目前市场上出现了很多添加低聚糖的婴幼儿配方奶粉,且成为了奶粉行业的一个销售亮点。但有的企业仅将功能性低聚糖作为宣传卖点,而在实际产品中添加的量极少,因此,建立一种适用于婴幼儿配方奶粉中低聚糖含量的检测方法显得尤为重要。

目前测定糖类物质的方法主要是比色法[20]、高效液相色谱法[21-25]、高效离子色谱法[7,9,26-27]等。比色法是利用显色反应,测定样品中总糖的含量,因此不具备选择性。高效液相色谱法一般与蒸发光散射检测器或示差折光检测器联用,因为糖类物质在紫外区和可见光范围内没有吸收,液相色谱法虽然无需衍生但灵敏度较低,难以满足食品中低含量糖类物质的检测。离子色谱法通常将阴离子交换色谱柱和脉冲安培检测器相结合,无需衍生和复杂的样品前处理即可检测大多数单糖和低聚糖,此方法操作简便,且灵敏度高。为此,本实验基于高效离子色谱技术的优点,采用CarboPac PA20色谱柱分离,通过梯度洗脱,利用脉冲安培检测器进行检测,实现蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、水苏糖、棉子糖、毛蕊花糖的同时检测,该方法能快速、准确、可靠地检测婴幼儿配方奶粉中功能性低聚糖含量,同时也为政府部门的监督管理和奶粉生产企业的质量控制提供一种新的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

乙腈(色谱纯) 美国Thermo Fisher公司;蔗果三糖(纯度≥99.3%)、蔗果四糖(纯度≥99.3%)、蔗果五糖(纯度≥94.4%) 日本和光纯药工业株式会社;蔗果六糖(纯度≥98%)、蔗果七糖(纯度≥98%)、水苏糖(纯度≥98.0%)、毛蕊花糖(纯度≥99.7%)上海普誉科贸有限公司;棉子糖(纯度≥99.5%)德国Dr. Ehrenstorfer公司;质量分数50%氢氧化钠溶液、无水乙酸钠(纯度≥99.0%) 美国Sigma Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

ICS-5000离子色谱仪(配有电化学检测器) 美国Thermo Fisher公司;电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司;Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司;5804离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 标准溶液的配制

分别称取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖标准品各100 mg于10 mL的容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,配制成质量浓度为10.0 mg/mL的单一标准储备液。使用前根据需要用超纯水稀释配制成不同质量浓度的混合标准液。

1.3.1.2 流动相的配制

流动相B:取13.1 mL质量分数50%氢氧化钠溶液,用水稀释定容至1 000 mL,在氮气保护下摇匀,配制成250 mmol/L氢氧化钠溶液。

流动相C:称取20.5 g无水乙酸钠,用约500 mL水溶解,加入2.6 mL 50%氢氧化钠溶液,并用水定容至500 mL,在氮气保护下摇匀,配制成500 mmol/L乙酸钠-100 mmol/L氢氧化钠溶液。

流动相D:称取20.5 g无水乙酸钠,用水溶解,并定容至500 mL,在氮气保护下摇匀,配制成500 mmol/L乙酸钠溶液。

1.3.2 高效离子色谱检测

采用离子色谱分析糖类物质时,其流动相一般为氢氧化钠溶液,随着流动相中氢氧化钠比例增大,分析时间缩短,但各峰的分离度降低,甚至会出现峰的重叠现象,同时难以排除杂质峰的干扰。若降低流动相中氢氧化钠的比例,则分析时间延长,且峰形会变差,尤其是保留时间较长的组分。本实验采用氢氧化钠和乙酸钠溶液进行梯度洗脱,流动相中乙酸根的加入,不仅可以改善功能性低聚糖的分离,同时可以提高响应的灵敏度。综合考虑低聚糖的峰形、灵敏度、分离度和分析时间,经过实验确定梯度洗脱条件如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase composition for gradient elution program

除了Dionex CarboPac PA20色谱柱,本实验还采用Dionex IonPac PA1色谱柱对低聚糖进行了检测分析,研究显示,各个低聚糖的保留时间变长,且出现了明显的拖尾现象。这是因为与PA20色谱柱相比,PA1色谱柱的基质粒径较大,其柱效明显低于PA20,故选择PA20色谱柱作为功能性低聚糖的分析柱。

高效离子色谱检测条件:色谱柱Dionex CarboPac PA20(150 mm×3 mm,6.5 µm);保护柱Dionex CarboPac PA20(30 mm×3 mm,6.5 µm);柱温30 ℃;流动相A:水,流动相B:250 mmol/L氢氧化钠溶液,流动相C:500 mmol/L乙酸钠-100 mmol/L氢氧化钠溶液,流动相D:500 mmol/L乙酸钠溶液,梯度洗脱;流速0.45 mL/min;进样量25 µL。脉冲积分安培检测器;工作电极Au电极;参比电极:Ag/AgCl电极。检测器检测波形见表2。

表2 糖测定的积分安培检测波形Table 2 Integrated pulsed amperometric detection waveforms for sugars

1.3.3 样品前处理

由于低聚糖在水中的溶解度较高,因此可以用水溶解样品进行提取,同时为了沉淀奶粉中的蛋白质,需在水中加入一定比例的乙腈。考察水-乙腈体积比为1∶0、3∶2、2∶3、0∶1时低聚糖的提取效果。

称取奶粉样品0.5 g(精确至0.000 1 g),置于10 mL容量瓶中,加水4 mL,振摇使其溶解,60 ℃水浴10 min。放置冷却至室温后,加乙腈至刻度,摇匀。静置10 min使其沉降(必要时延长沉降时间,或离心)。取上清液1 mL,加水稀释至10 mL,摇匀,过0.22 μm滤膜及1.0 CC OnGuard RP柱,滤液供色谱分析备用。

1.3.4 精密度和回收率测定

1.3.4.1 精密度测定

取空白样品6 份,分别添加1.3.1.1节50 μL 10.0 mg/mL蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果七糖、水苏糖和毛蕊花糖标准储备液,即添加量为100 mg/100 g,添加80 μL 10.0 mg/mL蔗果六糖和棉子糖标准储备液,即添加量为160 mg/100 g,然后按1.3.3节进行样品前处理,并按1.3.3节实验条件进行重复测定。

1.3.4.2 回收率测定

取空白样品18 份,分成3 组,分别加入低、中、高3 个水平的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖的标准储备液,进行样品分析,计算方法的回收率和相对标准偏差。

1.3.5 计算方法

1.3.5.1 样品中各组分含量的计算

在上述实验条件下,分别测定标准溶液及样品中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖的峰面积,以标准溶液中各组分的质量浓度作为横坐标,峰面积作为纵坐标,建立标准曲线。通过测得样品中各组分的峰面积,在标准曲线上得到样品溶液中各组分的含量,再通过式(1)计算得到样品中各组分的含量。

式中:Xi为样品中各组分的含量/(mg/100 g);ci为样品中各组分的质量浓度/(mg/L);V为样品的定容体积/mL;m为样品质量/g;R为样品的稀释倍数。

1.3.5.2 样品中功能性低聚糖含量的计算

样品中功能性低聚糖含量按式(2)计算:

式中:Xi为样品中各低聚糖组分的含量/(mg/100 g)。

2 结果与分析

2.1 样品前处理结果

实验结果表明,当在0.5 g样品中只加入10 mL水时,虽然样品能够溶解,但由于奶粉中的蛋白质没有完全沉淀,提取液呈浑浊;当在0.5 g样品中直接加入10 mL乙腈时,奶粉中的蛋白质与乙腈接触后发生变质,在奶粉的外层形成包裹,阻止样品的分散,导致样品内部的低聚糖无法提取完全。当水-乙腈体积比为3∶2时,由于乙腈的比例比较低,样品中蛋白质无法完全沉淀;当水-乙腈体积比为2∶3时,样品完全溶解,且提取液澄清透明,提取效果满意。综上所述,本实验采用4 mL水溶解样品,然后用乙腈定容至10 mL进行提取。

2.2 离子色谱检测结果

图1 功能性低聚糖标准溶液的离子色谱图Fig. 1 Chromatogram of a mixture of FOS standards

由图1可知,在本实验优化的梯度洗脱条件下,采用Dionex CarboPac PA20色谱柱实现了8 个功能性低聚糖的基线分离。

2.3 标准曲线、线性范围和检出限结果

表3 标准曲线、线性范围和检出限Table 3 Linear regression equations, linear ranges and detection limits of functional oligosaccharides

在优化的最佳实验条件下,将配制好的系列标准溶液依次进入离子色谱检测,以功能性低聚糖的质量浓度作为横坐标,峰面积作为纵坐标,进行线性回归,所得线性方程、线性范围及检出限(RSN=3)结果见表3。

2.4 精密度结果

表4 功能性低聚糖含量重复测定结果(n=6)Table 4 Repeatability (RSD) of the method (n= 6)

由表4可知,8 种功能性低聚糖检测方法的精密度相对标准偏差在1.57%~2.11%之间。

2.5 回收率结果

表5 方法的回收率和精密度(n= 6)Table 5 Recoveries and precision (RSD) of the analytical method (n= 6)

由表5可知,在本实验条件下,蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的回收率分别为82.5%~103%、82.5%~98.0%、82.5%~98.4%、87.5%~93.8%、80.0%~95.4%、88.4%~93.9%、81.0%~102%和83.0%~96.0%,相对标准偏差为1.01%~2.14%,表明此方法能准确、可靠地测定婴幼儿配方奶粉中功能性低聚糖的含量。

2.6 样品测定结果

采用本实验建立的离子色谱方法,对市场上销售的不同品牌的婴幼儿配方奶粉中功能性低聚糖含量进行检测分析。图2为某品牌奶粉样品的离子色谱图。由表6可以看出,在检测的10 批次婴幼儿配方奶粉中,其中4 批次样品中功能性低聚糖含量在400~500 mg/100 g,5 批次样品中功能性低聚糖含量在500~600 mg/100 g,1 批次样品中功能性低聚糖含量大于600 mg/100 g。

图2 婴幼儿配方奶粉中功能性低聚糖的离子色谱图Fig. 2 Chromatogram of GF2, GF3, and GF4 in infant formula milk powder

表6 婴幼儿配方奶粉中功能性低聚糖含量Table 6 Functional oligosaccharides contents in infant formula milk powder samples

实验数据显示,目前市场上销售的婴幼儿配方奶粉中主要含有蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖3 个功能性低聚糖,蔗果六糖和蔗果七糖均未检出,这可能与低聚果糖的生产工艺有关。以蔗糖为原料经过酶转化工艺生产的低聚果糖,其果糖链较短,主要是三糖、四糖、五糖,而六糖以上的低聚糖含量较低[28-29],进而导致添加到婴幼儿配方奶粉中的蔗果六糖和蔗果七糖含量偏低。在本实验所检测的婴幼儿配方奶粉中未检出水苏糖、棉子糖和毛蕊花糖,但是最新研究表明,水苏糖、棉子糖和毛蕊花糖对双歧杆菌的增殖效果及调节微生态的功能优于目前应用的所有低聚糖[30],其作为功能性低聚糖必将被广泛应用于婴幼儿配方奶粉等各类食品中。

3 结 论

本实验采用高效离子色谱法测定了婴幼儿配方奶粉中功能性低聚糖含量,通过对样品前处理条件和离子色谱参数的优化,实现了蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、水苏糖、棉子糖和毛蕊花糖的同时检测,该方法操作简便快速,测定结果准确可靠,适合于婴幼儿配方奶粉中低聚糖的检测,具有较高的应用价值。

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Determination of Functional Oligosaccharides in Infant Formula Milk Powder by High Performance Ion Chromatography

ZHU Wei, NING Xiaojun, DU Ruyun
(Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200233, China)

A method was established using high performance ion chromatography and pulsed amperometric detection for simultaneous analysis of 1-kestose (GF2), nystose (GF3), 1F-fructofuranosyl nystose (GF4), GF5, GF6, raffinose, stachyose and verbascose in infant formula milk powder. The chromatographic separation was achieved on a CarboPac PA20 column using a mobile phase composed of a mixture of sodium hydroxide and sodium acetate by gradient elution. Under the conditions optimized in this study, all the analytes were well separated, and the recoveries were 80.0%–103% with a relative standard deviation (RSD) less than 3% (n = 6). The method was rapid, accurate, reliable, and thus suitable for the determination of functional oligosaccharides in infant formula milk powder.

formula milk powder; functional oligosaccharides; high performance ion chromatography; pulsed amperometric detector DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724036

O657.7

A

1002-6630(2017)24-0224-05

朱伟, 宁啸骏, 杜茹芸. 高效离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中的功能性低聚糖[J]. 食品科学, 2017, 38(24)∶ 224-228.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724036. http∶//www.spkx.net.cn

ZHU Wei, NING Xiaojun, DU Ruyun. Determination of functional oligosaccharides in infant formula milk powder by high performance ion chromatography[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 224-228. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724036. http∶//www.spkx.net.cn

2017-02-16

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2014QK149)

朱伟(1982—),女,高级工程师,博士,研究方向为食品及化妆品的检测技术。E-mail:zhuwei@sqi.org.cn

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