响应面法优化南极磷虾粗脂肪索氏提取工艺

周 莉，李佩璇，赵钰灵，曾晓雄*

响应面法优化南极磷虾粗脂肪索氏提取工艺

周 莉，李佩璇，赵钰灵，曾晓雄*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

采用索氏提取法从南极磷虾中提取粗脂肪，分别考察提取溶剂、提取温度、提取时间和提取溶剂体积比对南极磷虾粗脂肪得率的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面法进行工艺优化，确定最佳提取条件为提取溶剂正己烷-无水乙醇（3.5∶1，V/V）、提取温度80 ℃、提取时间5.4 h。在此条件下，南极磷虾粗脂肪得率为12.32%。采用气相色谱法分析南极磷虾粗脂肪的脂肪酸组成，结果表明，粗脂肪中主要含有棕榈酸（C16:0，28.86%）、EPA（C20:5n3，15.48%）、油酸（C18:1n9c，12.71%）和二十二碳六烯酸（C22:6，12.22%）。不饱和脂肪酸的相对含量高达57.47%，其中单不饱和脂肪酸相对含量19.82%，多不饱和脂肪酸相对含量37.65%。因此，南极磷虾是多不饱和脂肪酸的新来源，具有较高的营养价值，可作为膳食营养补充剂广泛应用。

南极磷虾粗脂肪；脂肪酸；索氏提取法；响应面法

多不饱和脂肪酸是对人体健康起重要作用的一类脂肪酸，具有抗炎症、降低胆固醇、预防动脉粥样硬化等作用[1-3]。其中，ω-3系列的α-亚麻酸（C18:3）和ω-6系列的亚油酸（C18:2）是人体必需脂肪酸，需要从食物中摄取。鱼类等水产品中富含ω-3多不饱和脂肪酸[4]。鱼油作为保健食品在20世纪90年代开始流行，随着人们对鱼油保健功能的不断认识，鱼油作为保健食品的需求迅速增加。但是，在如今全球渔业资源衰退的背景下，鱼类的捕捞有所限制，因此，为了满足人类对ω-3多不饱和脂肪酸的需求，ω-3多不饱和脂肪酸的新来源亟需开发。2012年11月北欧海洋油脂会议指出南极磷虾是ω-3多不饱和脂肪酸的新来源。南极磷虾广泛分布于南极海域，是地球最大的单种生物资源之一，目前储量大约有5亿 t。南极海洋生物资源管理委员会指出，每年的南极磷虾捕捞量应控制在400万 t，但是，目前南极磷虾的年捕捞总量仅有20万 t左右，远低于其控制量[5]。由此可见，南极磷虾的生物储量十分充足且开发前景巨大。

南极磷虾的脂肪具有很高的营养价值，尤其是南极磷虾油中富含人类所必需的二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosehexaenoie acid，DHA）[6-8]。已有研究表明南极磷虾油在预防心血管疾病、促进大脑发育、提高记忆力、延缓衰老、缓解痛风和类风湿关节炎等方面具有显著功效[9-11]。因此，开发南极磷虾油不仅有重要的经济价值，而且具有重要的社会意义。目前，我国对于南极磷虾的研究处于起步阶段，本研究采用索氏提取法在不同条件下提取南极磷虾粗脂肪，采用单因素试验结合响应面优化提取工艺，得到最佳参数组合。最后，利用气相色谱（gas chromatography，GC）法分析南极磷虾粗脂肪中的脂肪酸组成，为有效利用南极磷虾资源提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾肉由辽宁省大连市海洋渔业集团提供，保存于-20 ℃冰箱；正己烷、无水乙醇、乙酸乙酯和石油醚购于南京化学试剂有限公司；37 种脂肪酸甲酯混合标准品购于美国Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Laborota 4000真空旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；LyoQuest-55真空冷冻干燥机 西班牙Telstar公司；BL-220H分析天平、2010Plus气相色谱仪 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将剁碎后的南极磷虾肉放置于真空冷冻干燥仪中干燥，然后将冷冻干燥后的虾肉用打粉机打碎、研磨成均匀的虾粉后置于-20 ℃冰箱保存[12]。

1.3.2 南极磷虾粗脂肪索氏提取

参照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》，使用索氏提取法对虾粗脂肪进行提取。单因素试验中分别改变提取温度、提取时间、提取溶剂的种类以及体积比来考察各因素对于虾粗脂肪得率的影响。粗脂肪得率的计算如式（1）所示：

式中：m1为虾粗脂肪的质量/g；m2为虾粉的质量/g。

1.3.3 粗脂肪的提取工艺优化

1.3.3.1 最佳提取溶剂的选择

南极磷虾中含有较高含量的双性脂质（磷脂）[13]，选用极性较大的有机溶剂（乙酸乙酯、无水乙醇）和常用的极性较弱的有机溶剂（石油醚、正己烷）进行组合可较充分地将不同极性的虾粗脂肪提取出来。分别采用石油醚-乙酸乙酯（2∶1，V/V）、正己烷-乙酸乙酯（2∶1，V/V）、正己烷-无水乙醇（2∶1，V/V）80 ℃各提取5 h。

1.3.3.2 单因素试验

在提取溶剂为正己烷-无水乙醇（2∶1，V/V）、提取时间5 h的条件下，考察提取温度（60、70、75、80、85 ℃）对南极磷虾粗脂肪提取效果的影响；在提取溶剂为正己烷-无水乙醇（2∶1，V/V）、提取温度80 ℃条件下，考察提取时间（3、5、7 h）对虾粗脂肪得率的影响；在提取温度80 ℃、提取时间5 h的条件下，考察提取溶剂正己烷-无水乙醇体积比（1∶2、2∶1、3∶1、4∶1）对虾粗脂肪得率的影响。

1.3.3.3 响应面试验

在单因素试验的基础上，确定正己烷-无水乙醇为提取溶剂，综合考虑提取温度、提取时间和提取溶剂体积比对南极磷虾粗脂肪得率的影响，采用Box-Behnken设计方案进行响应面分析，响应面试验设计因素与水平如表1所示。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.4 脂肪酸组成的GC分析

1.3.4.1 样品预处理

称取虾粗脂肪样品50 mg加入3 mL 0.5 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液，在55 ℃水浴锅中回流20 min，加入3 mL质量分数为13%三氟化硼-甲醇溶液，在55 ℃水浴锅中继续回流20 min，然后加入1 mL正己烷进行萃取。最后加入饱和NaCl溶液，分层后取上清液脱水后用于GC分析。

1.3.4.2 GC条件

色谱柱：SP 2560（100 m×0.25 mm，0.2 µm）；火焰离子检测器，柱温140～220 ℃（5 ℃/min），进样口温度260 ℃，检测器温度285 ℃；柱前压力（空气40 kPa、氢气400 kPa）；载气：高纯氮气（99.999%）。利用37 种脂肪酸甲酯混合标准品进行定性定量分析，结合峰面积归一化法计算其相对含量。脂肪酸相对含量的计算见式（2）：

式中：A为单个脂肪酸对应的峰面积；ΣA为所有脂肪酸对应的峰面积之和。

2 结果与分析

2.1 最佳提取溶剂的选择

表2 提取溶剂对虾粗脂肪得率的影响Table 2 Effect of extraction solvents on the yield of krill lipid

由表2可知，使用正己烷-无水乙醇（2∶1，V/V）的提取效果最好。一方面，根据相似相溶的原理，由正己烷将南极磷虾的非极性油提取出来[14]，而无水乙醇亲水性较强，且具有消除乳化作用，有利于油游离出来。另一方面，由于正己烷和无水乙醇均属于低毒试剂，在食品工业上可以应用。因此，选择正己烷-无水乙醇（2∶1，V/V）为提取条件。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对粗脂肪得率的影响

图1 提取温度对虾粗脂肪得率的影响Fig. 1 Effect of extraction temperature on the yield of krill lipid

由图1可知，随着提取温度的上升，南极磷虾粗脂肪得率呈上升趋势。导致这一现象的可能原因是随着温度的升高，分子的无规则运动速度加快，油和溶剂的黏度下降，扩散速率提高。然而，当温度达到83 ℃时，虾粗脂肪的提取率却有所下降，这可能是由于温度升高，脂肪氧化导致。另外，从生产成本角度考虑，温度不宜过高。所以选择80 ℃为最佳的提取温度。

2.2.2 提取时间对提取效果的影响

由图2可知，随着提取时间的延长，南极磷虾的脂肪得率呈升高的趋势，5 h和7 h的提取率相差不大，考虑到提取时间过长容易导致脂肪氧化。因此，选择5 h为最佳提取时间。

图2 提取时间对虾粗脂肪得率的影响Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of krill lipid

2.2.3 提取溶剂体积比对粗脂肪得率的影响

图3 提取溶剂体积比对虾粗脂肪得率的影响Fig. 3 Effect of solvent composition on the yield of krill lipid

由于正己烷和无水乙醇的极性相差较大[15]，这2种溶剂的体积比会影响溶剂极性的大小，从而影响南极磷虾油的提取效果。由图3可知，南极磷虾的粗脂肪得率随着正己烷-无水乙醇体积比的增大呈现先增后降的趋势。当正己烷-无水乙醇体积比为3∶1时粗脂肪得率最高。因此，选择正己烷-无水乙醇体积比为3∶1。

2.3 响应面试验优化结果

2.3.1 响应面设计与结果

在单因素试验的基础上，综合考虑提取温度、提取时间和提取溶剂体积比对南极磷虾粗脂肪得率的影响，试验设计与结果见表3。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 响应面模型方程建立与显著性分析

利用Design-Expert软件进行拟合得到的提取温度（A）、提取时间（B）和提取溶剂体积比（C）与虾粗脂肪得率之间的二次多项回归方程如下：

粗脂肪得率=12.26-1.14A＋0.27B＋2.45C＋0.045AB＋1.34AC-0.095BC-0.29A2-2.08B2-4.02C2

表4 响应面二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic model

回归方程中各变量的显著性程度由F值来判断，P值越小，则相应变量的显著性越高。由表4可知，该方程模型的P值为0.001 5，说明该模型差异显著（P＜0.05）；失拟项P值大于0.05，表明失拟不显著，说明试验设计中的组合数目是足够的，可得出自变量对粗脂肪得率的影响。R2为0.967 4，说明回归方程拟合度较好。此外，由F检验可知影响虾粗脂肪得率的主次因素为提取溶剂体积比＞提取温度＞提取时间。利用Design-Expert软件计算得出虾粗脂肪得率最高时的提取条件为提取温度80.4 ℃、提取溶剂正己烷-无水乙醇（3.51∶1，V/V）、提取时间5.36 h。在此条件下，虾粗脂肪得率的最大预测值为12.41%。崔秀明等[14]研究报道南极磷虾粗脂肪得率为14.76%，略高于该实验结果，可能与提取溶剂的种类和比例有关。

2.3.3 响应面交互作用分析

三维响应面和等高线图是回归方程的图形表现形式，可用来表示2 个测试变量和响应值与各变量水平之间的相互作用关系。本研究考察提取温度、提取时间和提取溶剂体积比3 个因素对南极磷虾粗脂肪提取效果的影响，响应面和等高线见图4。

图4 各因素对粗脂肪得率交互影响的响应面与等高线图Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interative effects of various factors on the yield of krill lipid

由图4可知，响应面图呈现先升高后降低的趋势，提取时间和提取溶剂体积比、提取温度和提取溶剂体积比的等高线较为密集，说明两因素之间的交互作用较显著，对虾粗脂肪的提取有较为重要的影响。

2.3.4 模型验证实验结果

考虑到实际操作的可行性，将虾粗脂肪的最佳提取条件调整为提取温度80 ℃、提取溶剂正己烷-无水乙醇（3.5∶1，V/V）、提取时间5.4 h。在此条件下进行索氏提取实验并进行3 次验证，所得的虾粗脂肪得率平均值为12.32%，与预测值（12.41%）相差不大，证明该结果合理可靠。因此，利用响应面法优化南极磷虾粗脂肪索氏提取工艺是有效可行的。

2.4 粗脂肪的脂肪酸组成

表5 南极磷虾粗脂肪的脂肪酸组成与相对含量Table 5 Relative contents of fatty acids in Antarctic krill lipid

采用GC法测定分析南极磷虾粗脂肪的脂肪酸组成，共检测到29 种脂肪酸。通过与37 种脂肪酸甲酯混合标准品的脂肪酸气相色谱保留时间相比较，鉴定出脂肪酸种类，并通过峰面积归一化方法计算每种脂肪酸的相对含量，结果如表5所示。分析鉴定出的脂肪酸中，以棕榈酸、EPA、油酸、DHA、肉豆蔻酸、棕榈油酸和亚油酸为主。其中，不饱和脂肪酸主要由多不饱和脂肪酸EPA、DHA和单不饱和脂肪酸油酸、棕榈油酸组成，占比57.47%。饱和脂肪酸则主要由棕榈酸和肉豆蔻酸组成，占比42.53%。李淡秋[16]研究发现，海水鱼中的饱和脂肪酸以C16:0最多，C14:0和C18:0次之，这与本方法制备的南极磷虾油极为类似。而在其他的一些研究中发现，C16:0在鲤鱼、草鱼和团头鲂等多种淡水鱼的饱和脂肪酸中也占很大的比例[17]。此外，林利民等[18]研究发现，海水鱼中DHA和EPA的相对含量总和在17.1%～29.9%之间，其中除了高体鰤一种海水鱼类含有29.9%的DHA＋EPA外，其他鱼类中DHA＋EPA的相对含量均在22.3%以下。而罗永康[19]研究表明，淡水鱼肌肉中DHA＋EPA的相对含量在1.4%～26.9%之间，其中除了鲢鱼肌肉中含有2.9%的DHA＋EPA，其他淡水鱼类这2 种不饱和脂肪酸的相对含量仅在1.4%～7.8%。而淡水鱼内脏中，除去鲢鱼、鲫鱼含量较高，达到24.7%和18%，其他鱼类DHA＋EPA相对含量不超过6.5%。DHA＋EPA的相对含量在螃蟹的蟹黄油中仅含7.92%[20]，而采用本方法提取的南极磷虾油DHA＋EPA的相对含量高达27.7%。刘坤等[21]采用亚临界R134a萃取工艺制得的磷虾油DHA相对含量10.13%，EPA11.69%。徐晓斌等[22]采用酶解法制得的南极磷虾油DHA相对含量8.99%，EPA 16.9%。这些方法制备的磷虾油脂肪酸含量总体与本结果相差不大，但DHA、EPA含量略低于本实验结果。

DHA和EPA是对人体极为重要的ω-3多不饱和脂肪酸。DHA和EPA在防治心脑血管疾病、抵抗炎症、维护母婴健康、改善先天性免疫力、抑制肿瘤生长等多方面起着极为重要的作用[23-26]。另外，由于南极磷虾中的ω-3多不饱和脂肪酸主要由磷脂的形式进行结合[27]，相比于鱼油中甘油三酯或者脂肪酸乙酯的形式更有助于降低甘油三酯及低密度脂蛋白的水平[28-29]，更易被人体吸收，并且不产生毒副作用[30]。因此，南极磷虾油具有较高的营养价值，可作为人类膳食和动物饲料的多不饱和脂肪酸的重要来源，对人体健康产生积极的影响。

3 结 论

本研究采用索氏提取法提取南极磷虾粗脂肪，首先通过单因素试验，分别考察提取温度、提取时间、提取溶剂以及提取溶剂体积比对南极磷虾粗脂肪得率的影响。根据单因素试验结果，确定正己烷-无水乙醇为提取溶剂，选择提取温度、提取时间和提取溶剂体积比为主要因素进行响应面优化试验，最终得出最佳工艺条件为提取温度80 ℃、提取溶剂正己烷-无水乙醇（3.5∶1，V/V）、提取时间5.4 h。在最佳条件下，南极磷虾粗脂肪得率可达到12.32%。通过GC分析法鉴定出南极磷虾粗脂肪中含有29 种脂肪酸，其中多不饱和脂肪酸相对含量达到37.65%，且以DHA与EPA为主，不饱和脂肪酸占57.47%，饱和脂肪酸占42.53%，且以棕榈酸为主。

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Optimization of Soxhlet Extraction of Antarctic Krill Lipid by Response Surface Methodology

ZHOU Li, LI Peixuan, ZHAO Yuling, ZENG Xiaoxiong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The Soxhlet extraction of lipid from Antarctic krill was optimized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The lipid yield was studied as a function of solvent type and composition, extraction temperature and time. The results showed that optimal extraction conditions that resulted in the maximum lipid yield of 12.32% were as follows: a mixture of hexane and ethanol (3.5:1, V/V) as extraction solvent, temperature 80 ℃, and time 5.4 h. Gas chromatography analysis showed that the lipid obtained was mainly composed of palmitic acid (C16:0,28.86%), eicosapentaenoic acid (C20:5n3, 15.48%), oleic acid (C18:1n9c, 12.71%) and docosahexaenoic acid (C22:6, 12.22%).The unsaturated fatty acid content was above 57.47%, with monounsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids accounting for 19.82% and 37.65%, respectively. Therefore, Antarctic krill is a novel source of polyunsaturated fatty acids,and has high nutritional value and could be widely used as dietary supplements.

Antarctic krill lipid; fatty acid; Soxhlet extraction; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201724026

TS272；TS201.3

A

1002-6630（2017）24-0165-06

周莉, 李佩璇, 赵钰灵, 等. 响应面法优化南极磷虾粗脂肪索氏提取工艺[J]. 食品科学, 2017, 38(24): 165-170.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201724026. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Li, LI Peixuan, ZHAO Yuling, et al. Optimization of Soxhlet extraction of Antarctic krill lipid by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 165-170. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724026. http∶//www.spkx.net.cn

2017-05-15

国家自然科学基金青年科学基金项目（NSFC31501521）；江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20140701）

周莉（1985—），女，副教授，博士，研究方向为食品营养与化学。E-mail：zhoul@njau.edu.cn

*通信作者：曾晓雄（1964—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：zengxx@njau.edu.cn