基于人工模拟抗体的酶联检测技术在食品安全检测中的应用

何彦平，金 涌，陈 达，邢仕歌，王燕飞，薛 强，齐小花，邹明强,*

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；2.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；3.中检国研（北京）科技有限公司，北京 100123）

基于人工模拟抗体的酶联检测技术在食品安全检测中的应用

何彦平1,2，金 涌1,3，陈 达2，邢仕歌1，王燕飞1,3，薛 强1,3，齐小花1,3，邹明强1,3,*

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；2.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；3.中检国研（北京）科技有限公司，北京 100123）

广义人工模拟抗体包括适配体、重组受体、分子印迹聚合物及多肽。人工模拟抗体与传统抗体相比优势显著，其具有易实现工业化生产、成本低、保存方便、可反复使用等特点。酶联检测技术是人工模拟抗体在食品安全检测中应用最为广泛的技术。本文综述了人工模拟抗体的特点以及基于人工模拟抗体的酶联检测技术在食品安全检测中的应用。

适配体；重组受体；分子印迹聚合物；多肽；人工模拟抗体；酶联检测技术；食品安全检测

人工模拟抗体是广义上的抗体，其模拟抗体-抗原专一性相互作用，以分子识别为基础与目标物特异性结合，包括适配体[1-4]、重组受体[5-6]、分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）[7-10]和多肽[11]。之前的研究中，人工模拟抗体被定义为一种具有分子识别能力的新型高分子材料（MIP）[12]。随着新型检测元件的发展，人工模拟抗体的范围越来越广，其包括单链DNA或RNA分子、重组蛋白、新型高分子材料和多肽，因具有分子识别能力而作为检测元件应用于多种检测技术。近年来，人工模拟抗体的研究聚焦于替代传统抗体应用于疾病诊断[13-14]、食品安全检测等领域，以降低检测成本，提高检测的稳定性和灵敏度。在食品安全检测中，适配体、重组受体、MIP和多肽可以替代传统抗体作为检测元件，并在酶联检测方法中有较多应用。

酶联检测方法发展于20世纪70年代，具有高准确性和特异性。基于人工模拟抗体，酶联检测方法以人工模拟抗体作为检测元件，酶作为标记物，因成本低、检测元件来源广泛等优势在食品安全检测中应用日益广泛。本文将对人工模拟抗体以及基于人工模拟抗体酶联检测技术在食品安全检测中的应用展开论述。

1 基于人工模拟抗体的酶联检测技术在食品安全检测中的应用

1.1 基于适配体的酶联检测技术在食品安全检测中的应用

图1 人工模拟抗体与目标物示意图Fig. 1 Schematic illustration of artif i cial antibodies and targets

寡核苷酸适配体，又称适配体[1-2]，是通过指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术筛选得到的能够与相应配体靶分子特异性紧密结合的单链DNA或RNA分子。单链寡核苷酸碱基之间的相互作用会形成许多空间构象（如发卡、假结、口袋或G-四碱基体等），基于这些独特的三维空间构象匹配、序列中碱基的堆积作用、带电基团之间的静电作用或氢键作用，适配体实现与靶分子的高亲和力高特异性结合[1,15]（图1A）。与传统抗体相比[16]，适配体的优点是靶分子范围广、筛选周期短等；但RNA适配体易被酶降解，多数适配体亲和力略差于传统抗体（表1）。

表1 人工模拟抗体与传统抗体比较Table 1 Comparison of artif i cial and conventional antibodies

在食品安全检测中，由于适配体易于筛选和制备，基于适配体的酶联检测技术有着广泛的应用（表2）。Barthelmebs等[17]建立了基于适配体酶联检测直接竞争模式，可以快速检测红酒中的赭曲霉毒素A。该方法是以HRP作为标记酶，四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）作为底物的比色法。赭曲霉毒素A适配体的平衡解离常数（KD）为130 nmol/L，与赭曲霉毒素B和苯基丙氨酸几乎无交叉反应。

Wang Sai等[18]建立了基于适配体酶联检测的间接竞争方法快速检测蜂蜜里的四环素残留。四环素适配体的KD是63.6 nmol/L，与四环素类似物几乎无交叉反应；与其他方法相比，该方法有更高的灵敏度（检测限是9.6×10-3ng/mL）、更宽的线性范围（0.01～100 ng/mL）和更高的回收率（蜂蜜中平均回收率为93.23%）。Wang Yuankai等[19]筛选出玉米赤霉烯酮单抗的适配体，通过间接竞争酶联方法提高玉米赤霉烯酮检测限，拓宽了适配体在酶联检测技术中的应用，将检测物单抗的适配体运用到检测方法中，提高了检测的特异性和灵敏度。

表2 基于人工模拟抗体酶联检测技术在食品安全中的应用Table 2 Applications of enzyme-linked assays based on arti fi cial antibodies in food safety detection

Nie Ji等[20]首次建立了基于适配体的夹心法检测可卡因。该方法将可卡因的适配体剪成2 个片段，一个片段固定到96 孔板上，另一个片段标记生物素；当2 个片段和目标物同时出现时，就会形成一个适配体片段/目标物的复合物，实现了夹心法检测目标物，提高可卡因检测的特异性和灵敏度。

综上所述，目前基于适配体酶联检测技术包括直接竞争法、间接竞争法和夹心法。夹心法创造性地将一个适配体剪成2 段应用到分析技术中，可有效提高检测的灵敏度和特异性，是基于适配体酶联检测技术的一个重要发展方向。

1.2 基于重组受体的酶联检测技术在食品安全检测中的应用

受体（receptor）[29-30]是一类存在于细胞膜或细胞内的特殊蛋白质，其能与细胞外专一信号分子结合进而激活细胞内一系列生物化学反应，使细胞对外界刺激产生相应效应。重组受体[21-23]可通过基因工程的方法在细胞中大量表达，利用受体可特异结合信号物质（配体）的特性，可将纯化的重组受体作为检测元件应用到分析技术中（图1B）。重组受体可以对一类药物进行多残留检测，如Liang Xiao等[21]建立酶联磺胺受体（dihydropteroate synthase，DHPS）检测方法，可以检测9 种磺胺类药物和对氨基苯甲酸，而抗体大多只能特异性的检测一种或少数几种物质（表1）；但重组受体由于分子质量较大，在表达纯化过程中易由于不正确折叠而失去活性。

在食品安全检测中，基于受体的酶联检测技术因能实现多残留检测从而应用日益广泛（表2）。Seifert等[5]以POD为标记酶，建立基于人类雌激素α受体酶联检测方法，高通量低成本地筛查水样品中的17 beta-雌二醇。当配体是17 beta-雌二醇时，该受体的KD是2.33×10-10mol/L，与17 beta-雌二醇类似物有较强交叉反应，与其他物质无交叉反应。Cheng Guyue等[23]建立了一个基于叙利亚仓鼠beta2-肾上腺素受体酶联检测方法，该方法可以筛查动物饲料中的3 个beta-激动剂（RAC、克伦特罗和沙丁胺醇），对RAC的灵敏度是5.20 μg/L，对克伦特罗和沙丁胺醇的交叉反应分别是87.7%和58.5%；与传统方法比，该方法整个过程只需要45 min（更快速）且可同时检测一组beta-激动剂（高通量）。Zhang Jing等[22]运用可溶的青霉素结合蛋白3（soluble form of penicillin-binding protein 3，sPBP3）建立了酶联检测方法检测牛乳中的青霉素类和头孢菌素类抗生素。该受体与27 种beta-内酰胺类药物有很强交叉反应；建立的方法可以检测11 种青霉素类和16 种头孢菌素类抗生素，且检测限都在欧盟设定的最大残留限定（maximum residue levels，MRLs）之下。

基于受体酶联检测技术检测目标物数量最高可达27种，可以有效地提高检测效率，降低检测成本，最大限度满足食品安全检测中多残留检测的要求。由于重组受体的特异性弱，该技术无法区分有交叉反应的目标物，不适合食品安全中特定目标物的检测。

1.3 基于MIP酶联检测技术在食品安全检测中的应用

MIP[31]是一种具有分子识别能力的新型高分子材料。在模板分子存在的情况下，功能单体和交联剂由引发剂引发而发生共聚合。由于模板分子和功能单体之间存在共价或非共价的作用，功能单体按照一定的顺序排列在模板分子的周围。洗去模板分子后，这样在聚合物中就留下与模板分子大小、形状、功能团互补的孔穴，表现出分子配位识别效应（图1C）。MIP与传统抗体相比[7,31-32]，对制备技术要求不高，并且具有良好的耐酸、碱、高温等性质，合成成本低，保存时间长等优点；但MIP的亲和力和特异性要略差于传统抗体（表1）。

在食品安全检测中，因MIP成本低且制备简便，基于MIP的酶联检测技术具有广泛应用（表2）。Surugiu等[24]使用TOP作为标记物建立了基于MIP酶联检测方法用于检2,4-D。该方法比酶联免疫吸附测定法成本低且稳定性更好。Fang Guozhen等[25]制备分子印迹膜作为人工模拟抗体，建立直接竞争的基于分子印迹膜酶联检测方法检测尿液和猪肉样品中的RAC。该方法灵敏度高（半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为15.77 μg/L）、检测限低（IC15为0.01 μg/L），与高效液相色谱的结果相关系数大于0.99。Liu Huilin等[26]建立了一个直接竞争的基于分子印迹膜酶联检测方法检测水和土壤中的TBM，该检测方法灵敏度高（IC50为19.73 μg/L）且检测限低（IC15为0.30 μg/L）。与TBM抗体相比，TBM分子印迹膜成本更低、稳定性更好且制备周期更短。

基于MIP酶联检测技术能达到较低的检测限和较高的回收率；其最大的优势是可以直接在96 孔板中合成，合成过程简单、周期短、成本低。由于MIP的目标物是小分子，该技术对食品安全中的大分子有毒有害物质无法检测。

1.4 基于多肽的酶联检测技术在食品安全检测中的应用

人工模拟抗体多肽[11]由2～50 个氨基酸组成，具有分子识别能力，可以与目标物特异性结合。近年来，人工模拟抗体多肽由于结构简单、易实现非竞争法检测小分子物质，在检测领域有了长足的发展，其主要包括来源于噬菌体展示的多肽[33-34]（图1D）、设计合成的多肽[35]、小型化受体的多肽[36]和配体来源的多肽[37]。人工模拟抗体多肽易于化学合成、成本低廉；但其亲和力略差于传统抗体。

在食品安全检测中，因多肽筛选与鉴定效率高并可以建立非竞争的检测模式，基于多肽酶联检测技术包括噬菌体抗免疫复合物分析法（phage anti-immunocomplex assay，PHAIA）受到越来越多的重视。Dong Jiexian等[27]建立基于多肽的非竞争的噬菌体抗免疫复合物分析法检测鱼样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿。该方法的灵敏度是抗体竞争法的16 倍。Vanrell等[28]通过化学法合成了来源于噬菌体展示的多肽，并使用该多肽建立了非竞争酶联检测方法用于检测草达灭和广灭灵，与抗体竞争法相比灵敏度分别提高了18 倍和3.3 倍。

基于多肽酶联分析方法可以建立非竞争方法检测食品中有毒有害的物质，提高了方法的灵敏度和阳性检出率。作为新型检测元件，多肽在食品安全检测中的应用将是一个重要方向。

2 结 语

人工模拟抗体非来源于传统抗体，模仿传统抗体作为分子识别元件应用于分析检测。由于食品安全检测中目标物（大多是半抗原小分子物质）的传统抗体较难获得，人工模拟抗体将替代传统抗体在分析检测中发挥更大的作用。在未来的食品安全检测中，人工模拟抗体将会在以下两方面得到更进一步的发展。

首先，更多的新型检测材料将作为人工模拟抗体应用于检测中。人工模拟抗体的来源广泛，可以是DNA或RNA（适配体）、重组蛋白（重组受体）、多肽、小分子聚合材料（MIP）或是其他来源的物质。只要该物质具有检测元件所必须的特异性和敏感性，并具有比传统抗体更优越的性能，能够作为其补充和延伸，替代传统抗体作为分析技术中的检测元件，它就可以被定义为人工模拟抗体。目前学者研究较多的人工模拟抗体包括适配体、重组受体、MIP和多肽。新型检测材料作为人工模拟抗体需要很长的探索阶段和更多的实验考证。随着技术的发展，相信会有更多的人工模拟抗体替代传统抗体在食品安全分析技术中广泛使用。

其次，人工模拟抗体将会应用到各种新兴的分析技术中。免疫学检测技术有放射免疫法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。其中，酶联分析方法因灵敏度高、操作简便、成本低而发展得最为成熟。基于人工模拟抗体的酶联检测技术是人工模拟抗体替代传统抗体在食品安全检测中应用最广泛的技术，主要应用于真菌毒素残留、农兽药残留等。人工模拟抗体在其他食品安全免疫学检测技术中的应用也有报道，如胶体金层析法[38-39]、电化学传感器技术[40]等。随着食品安全检测技术的发展，人工模拟抗体将会和一些新兴的分析技术相结合，如时间分辨荧光免疫分析法、均相免疫分析技术、微流控技术等，以提高检测灵敏度及降低检测成本。

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Application of Arti fi cial Antibody in Enzyme-Linked Assay for Food Safety Detection

HE Yanping1,2, JIN Yong1,3, CHEN Da2, XING Shige1, WANG Yanfei1,3, XUE Qiang1,3, QI Xiaohua1,3, ZOU Mingqiang1,3,*
(1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China; 2. School of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 3. Zhong Jian Guo Yan (Beijing) Technology Co. Ltd., Beijing 100123, China)

Generalized artif i cial antibodies include aptamers, recombinant receptors, molecularly imprinted polymers and polypeptides. Artificial antibodies are significantly advantageous over conventional antibodies in terms of their ease of industrial production, low cost, ease of storage and reutilizability. In food safety detection, the most widely used technique is enzyme-linked assay based on artif i cial antibody. This paper reviews the benef i ts and drawbacks of applying aptamers,receptor, molecularly imprinted polymers and polypeptides in enzyme-linked assay, as well as the prospect of artificial antibody in enzyme-linked assay for food safety detection.

aptamer; recombinant receptor; molecularly imprinted polymer; polypeptide; artif i cial antibody; enzyme-linked assay; food safety detection

10.7506/spkx1002-6630-201723049

TS201.6

A

1002-6630（2017）23-0313-05

何彦平, 金涌, 陈达, 等. 基于人工模拟抗体的酶联检测技术在食品安全检测中的应用[J]. 食品科学, 2017, 38(23): 313-317.

10.7506/spkx1002-6630-201723049. http://www.spkx.net.cn

HE Yanping, JIN Yong, CHEN Da, et al. Application of artificial antibody in enzyme-linked assay for food safety detection[J]. Food Science, 2017, 38(23): 313-317. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723049. http://www.spkx.net.cn

2016-09-05

国家重点研发计划重点专项（2016YFF0203802）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAK44B01）；国家自然科学基金青年科学基金项目（21305101）；国家重大科学仪器设备开发专项（2012YQ0901970501）

何彦平（1985—），男，博士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：heyanping85521@163.com

*通信作者：邹明强（1964—），男，研究员，博士，研究方向为食品安全检测。E-mail：mingqiangz@sina.com