基于玫瑰茄花青素的猪肉新鲜度智能指示膜研究

邹小波，张俊俊，石吉勇，蒋彩萍，翟晓东，王 圣，赵 号，梁妮妮

（江苏大学食品与生物工程学院，农产品加工及贮藏工程实验室，江苏 镇江 212013）

基于玫瑰茄花青素的猪肉新鲜度智能指示膜研究

邹小波，张俊俊，石吉勇，蒋彩萍，翟晓东，王 圣，赵 号，梁妮妮

（江苏大学食品与生物工程学院，农产品加工及贮藏工程实验室，江苏 镇江 212013）

本研究以玫瑰茄花青素提取物制备可检测肉类新鲜度的智能指示膜，分别以淀粉、壳聚糖和聚乙烯醇两两混合作为成膜基底材料，比较分析了不同基底材料复合膜在机械性能、水溶性、微观结构以及颜色稳定性等方面的差异。结果表明：壳聚糖/聚乙烯醇/玫瑰茄花青素复合膜的抗拉强度最大，为98.28 MPa；聚乙烯醇/淀粉/玫瑰茄花青素复合膜的断裂伸长率最大，为88.16%，含水率最低且稳定性最高；扫描电子显微镜结果表明不同基底材料复合膜的微观结构差异较大。将聚乙烯醇/淀粉/玫瑰茄花青素复合膜用于猪肉新鲜度的检测，结果表明：在25 ℃贮藏环境下，随着时间延长，猪肉的挥发性盐基氮的含量不断上升，36 h后，猪肉的挥发性盐基氮值大于15 mg/100 g，表明猪肉已经腐败，同时复合膜的颜色变成淡紫色，60 h后变为褐色。研究结果可为猪肉新鲜度智能指示膜的研究开发提供参考。

指示膜；猪肉；新鲜度；玫瑰茄花青素；淀粉；壳聚糖；聚乙烯醇

食品智能包装能监测并指示食品包装内部环境的变化，从而实时反映食品在储藏和运输过程中相关质量信息[1]。食品智能包装技术主要包括指示器、数据载体和传感器等[2]。其中色敏型的指示器能够通过颜色变化实时、直观地反映食品的品质变化，具有广泛的应用前景。

肉类在腐败过程中，蛋白质分解会产生大量挥发性有机胺类如三甲胺等，造成包装空间内pH值上升[3]，因此，许多学者利用pH值敏感材料制备出可以反映肉类新鲜度的色敏型智能包装。孙媛媛等[3]制备了羟丙基甲基纤维素与溴甲酚紫混合膜，可用于指示猪肉新鲜度。Kuswandi等[4]以聚苯胺为pH值敏感材料制备出能够监测鱼肉新鲜度的智能包装膜。然而，大多人工合成的pH值敏感材料具有一定毒性，用作食品包装具有安全隐患。

花青素是一种无毒无害的天然色素，且会随着pH值的变化呈现出不同的颜色[5]。近年来，以花青素为pH值敏感材料开发色敏型智能指示膜成为研究的热点之一。Choi等[6]将紫薯花青素与琼脂淀粉共混制备指示膜，研究表明随着猪肉的新鲜度下降，膜的颜色由红到绿。Zhang Xiahong等[7]利用壳聚糖与洋紫荆花色素成功制备出可用于肉类食品新鲜度检测的智能指示膜。玫瑰茄是一种草本植物，其花萼中含有大量的花青素，其中以飞燕草素和矢车菊素类糖苷类居多，其脱酰化程度高，稳定性高[8]，可以作为本研究指示膜的显色剂。

制备上述指示膜的过程中，淀粉、壳聚糖、聚乙烯醇等可降解的成膜材料常作为固定花青素的基底材料。基底材料的特性直接决定了指示膜的机械性能、成膜材料之间的相容性以及显色性能等，且目前对于不同基底材料指示膜之间差异性研究尚待开展。

因此，本研究以从玫瑰茄中提取花青素作为显色剂，以淀粉-壳聚糖（starch-chitosan，CS）、壳聚糖-聚乙烯醇（chitosan-polyvinyl alcohol，CP）、淀粉-聚乙烯醇（starch-polyvinyl alcohol，SP）作为智能指示膜的基底材料，制备出不同色敏型的智能指示膜并比较其性能差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪肉、玫瑰茄 江苏省镇江市欧尚超市；壳聚糖（食用级）、淀粉、无水乙醇 华东器化玻有限公司；甘油、聚乙烯醇、乙酸溶液 国药集团有限公司。

1.2 仪器与设备

Nicoletis50型傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）仪 美国Thermo Fisher公司；UV-vis 7220N型紫外-可见分光光度计北京瑞利分析仪器有限公司；RE-1002型旋转蒸发仪郑州豫华仪器制造有限公司；TA-XT2i型质构仪 英国Stable Micro Systems公司；Color Quest XE型色差仪 美国Hunter Lab仪器公司；7001F型扫描电子显微镜 日本JSM公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素的提取

将玫瑰茄花萼烘干磨成粉末并过80 目筛，以75%的乙醇溶液作为提取剂，按照料液比1∶20（m/V）混合，于40 ℃的恒温水浴锅中浸提3 h后取出，抽滤后即可得到花青素醇溶液[9]。将花青素醇溶液在50 ℃避光条件下旋转蒸发浓缩除去乙醇得到花青素浓缩液。最后将花青素浓缩液进行真空冷冻干燥得到玫瑰茄花青素粉[6]。

1.3.2 花青素在不同pH值下的紫外-可见光谱

利用紫外-可见光分光光度计测量玫瑰茄花青素在pH 2～12范围下的紫外-可见光谱[10]，扫描波长为400～800 nm。

1.3.3 指示膜的制备

指示膜主要通过流延干燥法制备而成。取2 g壳聚糖溶于100 mL体积分数为2%的乙酸溶液中并加入1 mL丙三醇，于常温下搅拌至溶解[11]；取2 g淀粉溶于100 mL蒸馏水并添加1 mL丙三醇，在100 ℃下搅拌糊化30 min；取2 g聚乙烯醇溶于100 mL蒸馏水并添加1 mL丙三醇在100 ℃加热搅拌至溶解[12]。各取淀粉、壳聚糖、聚乙烯醇溶液50 mL进行两两混合，然后加入0.025 2 g玫瑰茄花青素粉，通过磁力搅拌器搅拌均匀制得淀粉/壳聚糖/玫瑰茄花青素（starch/chitosan/roselle anthocyanins，CSR）、壳聚糖/聚乙烯醇/玫瑰茄花青素（chitosan/polyvinyl alcohol/roselle anthocyanins，CPR）、淀粉/聚乙烯醇/玫瑰茄花青素（starch/polyvinyl alcohol/roselle anthocyanins，SPR）混合溶液[13]。分别取18 mL混合溶液经超声去泡后倒入直径为9 cm的培养皿中，并于30 ℃烘箱中烘干成膜。揭膜后，将膜避光放置到恒温恒湿箱中待用。具体流程见图1。

图1 指示膜的制备流程Fig. 1 Process fl ow chart for developing composite fi lms

1.3.4 指示膜的表征

1.3.4.1 指示膜的FT-IR图

用Nicoletis 50型FT-IR仪在透射模式下测定指示膜的红外吸收光谱。扫描波数为650～4 000 cm-1，分辨率为2 cm-1，扫描次数为3 次[14]。

1.3.4.2 指示膜厚度及机械性能和含水率的测试

指示膜厚度采用电子数显千分尺（±0.001 m）进行测定，每张膜随机取3 个点后测量，结果取平均值[15]。抗拉强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation at break，EB）参照GB 13022—1991《塑料 薄膜拉伸性能试验方法》[16]。将膜裁剪成60 mm×20 mm的长条，通过TA-XT2i质构分析仪测定完成[17]。每组试样测3 次取平均值，测量时设置初始拉伸距离为40 mm，拉伸速率为0.6 mm/s。TS和EB分别按照公式（1）、（2）计算。

式中：F为拉长过程中最大的力/N；S为指示膜有效受力横截面积/m2。

式中：L1为断裂时膜的长度/mm；L0为膜的原始长度/mm。

含水率（moisture content，MC）的测量采用直接干燥法。直接称取质量相同的不同基底材料的指示膜装入洁净干燥且质量恒定的烧杯，并置于105 ℃的烘箱内烘3 h至质量恒定后停止实验，每组指示膜平行测定3 次。含水率按照公式（3）计算。

式中：m1为指示膜的初始质量/g；m2为指示膜经干燥至质量恒定时的质量/g。

1.3.4.3 指示膜颜色的微观结构

用7001F型扫描电子显微镜观察指示膜的横切面结构并拍照。测量前用液氮将指示膜冷冻断裂，并经过真空溅射喷金，加速电压为15 kV。

1.3.4.4 指示膜的稳定性测定

将指示膜分别放置在4、25 ℃，相对湿度为75%的恒温恒湿箱中保存。利用色差仪根据CIE-L*a*b*颜色系统，L*表示明亮度，a*为红绿度，b*为黄蓝度。以标准白板为色差参比，每隔2 d测定一次指示膜的颜色指标。按照公式（4）计算ΔE。

式中：ΔL*＝L*-L0*、Δa*＝a*-a0*、Δb*＝b*-b0*；L*、a*、b*为待测样品的实测值；L0*、a0*、b0*为标准白板的值，分别为91.13、-0.76、3.58。

1.3.5 指示膜检测猪肉新鲜度

首先将当天购买的新鲜猪肉用无菌刀具裁剪成10 g的肉块。然后将指示膜剪切成 2 cm×2 cm的正方形并放入直径为5 cm的塑料培养皿，并将其连同猪肉一并放置于直径9 cm的塑料培养皿中，用保鲜膜密封塑料培养皿并置于25 ℃的恒温恒湿箱中。每12 h测定一次智能指示膜的颜色（L*、a*、b*）并计算ΔE，并按照国标GB 2733—2015《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[18]测定肉的挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）。

1.4 数据统计分析

应用SPSS软件，利用Duncan方法进行方差分析，结果用 ±s来表示，p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 玫瑰茄花青素的紫外-可见光谱

图2 玫瑰茄花青素在pH 2～12的颜色及紫外可见光谱Fig. 2 Color and ultraviolet-visible spectra of roselle solutions at pH 2-12

如图2A所示，在pH 2～12的范围内，玫瑰茄花青素的颜色随着pH值的升高由红到蓝后再变成黄色。由图2A、B可知，当pH值小于5时，玫瑰茄花青素颜色呈粉红色，其最大吸收峰在波长527 nm附近，但随着pH值的升高，花青素的最大吸收波长从527 nm向545 nm方向移动，同时最大吸收波长处的吸光度明显下降。然后，随着缓冲溶液的pH值继续增至7后，花青素的颜色呈现紫色，最大吸收波长移至597 nm波长处。通常来说在可见光波长范围内的吸光度反映其互补颜色的色度，如花青素在绿色波段下的吸光度显示的就是其互补色即红色。因此红色波段最大吸收波长和绿色波段最大吸收波长的比值可用于反映颜色变化，比值越大，则说明样品绿色的颜色越深。从图2C、D中在pH 2～9时可以看出随着pH值的升高，吸光度的比值线性增加，绿色不断加深，且它们之间呈线性变化，其线性回归方程为y＝0.087 9x-0.015 5，R2＝0.985 9。

在不同pH值下玫瑰茄花青素颜色改变的原因是自身结构的转变[19]。在pH 2～3时，溶液中花青素主要存在的形式是黄烊盐离子，溶液呈现红色；而在pH 4～6时其结构逐渐转变为醌型碱的形式，红色下降；在pH 7～9时其结构向无色的假碱、查尔酮偏移，颜色逐渐呈蓝色；最后当pH大于9时，花青素在强碱性的环境下被降解，颜色变为黄绿色[20]，这也是（图2C）中玫瑰茄花青素在pH值大于9时不稳定的原因。

2.2 指示膜的FT-IR谱图

图3 壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、玫瑰茄花青素和指示膜的FT-IR谱图Fig. 3 FT-IR spectra of chitosan, starch, polyvinyl akohol, roselle anthocyanins and indicator fi lms

从图3可以看出，光谱在3 270 cm-1处有明显的O—H键的伸缩振动吸收，这可能因为淀粉、聚乙烯醇、壳聚糖、玫瑰茄花青素单体中均含有羟基。2 932 cm-1和2 946 cm-1分别是有机化合物中的特征结构—CH2和—CH的伸缩振动。SPR膜的谱图在1 779 cm-1处存在一个弱强度的肩峰，这是典型的黄酮类化合物结构中呋喃环的振动[21]，另外在1 646 cm-1和1 556 cm-1处是芳香环架中C＝C振动，与花青素中的芳香物质对应[22]，这些特征峰在3 种指示膜中均有体现。1 392 cm-1处为壳聚糖的敏感结晶峰，但在含壳聚糖的复合物中，对应的结晶峰移动至1 409 cm-1处，由此，可能是由于复合物之间形成了较强的分子间作用，打乱了壳聚糖正常的结晶状态[23]。淀粉光谱中1 018、1 025 cm-1和1 149 cm-1对应的是其结构中的C—O、C—C以及O—H的不对称弯曲振动[24]，因此CSR膜和SPR膜中存在同样的变化。综上，由FT-IR谱图可知，物质结构间主要受分子间作用力影响，而化学成分没有改变。

2.3 指示膜的表征

2.3.1 指示膜厚度与机械性能

表1 指示膜的膜厚度、含水率和机械性能Table 1 Thickness, water content and mechanical properties of the indicator fi lms

从表1中可以看出指示膜间的含水率存在显著差异（p＜0.05）：SPR膜＜CPR膜＜CSR膜；CPR膜的TS最高，为98.28 MPa，其次是SPR膜，CSR膜的TS最低。有研究表明膜TS的大小与其结晶结构和分子间的氢键作用有关[25]，因此，指示膜的差异可能是聚乙烯醇、淀粉、壳聚糖分子中羟基数目的不同导致的，另外，聚乙烯醇在成膜的过程中机械性能良好，而淀粉却因脆性较大，机械性能差[26]。3 种膜的厚度虽无显著差异（P＞0.05），但EB差别较大（p＜0.05），其中SPR膜的EB最高（88.16%），是因为聚乙烯醇的分子链上含有大量的羟基与淀粉可以发生强烈的相互作用[26]。

2.3.2 指示膜的扫描电子显微镜图

扫描电子显微镜图可以反映出物质之间分散状态和界面之间的相容性。一般来讲，物质的相容性高，其表面就相对均匀，相反就呈较粗糙的颗粒状[27]。由图4可知，CPR膜和SPR膜的表面光滑，且截面之间比较规则、结构紧致，表明CPR膜和SPR膜均有良好的生物相容性，然而CSR膜的表面粗糙，有网状结构且内部疏松，对应于CSR膜较差的机械性能和生物相容性。

图 4 指示膜的横切面扫描电子显微镜图Fig. 4 Scanning electron micrographs of the cross sections of the indicator fi lms

2.3.3 指示膜颜色稳定性

3 种不同基底材料的智能包装膜在2 种不同温度（4 ℃和25 ℃）下的颜色变化如图5所示。通过比较指示膜的颜色差异结合色差值，得出膜的颜色稳定性：SPR膜＞CPR膜＞CSR膜，含有壳聚糖材料在贮存的过程中自身颜色会变黄，会造成指示膜颜色识别的误判[28]。另外，可能是成膜基底材料的pH值不同造成膜颜色的稳定性差异。同时从图5中可以发现，膜在4 ℃时的稳定性明显高于25 ℃。从花青素的角度解释，随着温度升高，花青素的稳定性降低。温度的升高使花青素的结构发生变化，加快二苯基苯并吡喃阳离子向查尔酮与无色假碱的方向反应，造成醌型碱和有色黄洋盐离子的减少[20]，最终使得花青素颜色向短波方向移动，发生明显的颜色变化，从而使膜的稳定性降低。

图5 指示膜在4（A）、25 ℃（B）下贮藏16 d的颜色变化Fig. 5 Color change of the indicator fi lms stored at 4 (A) and 25 ℃ (B)for 16 d

2.4 指示膜应用于指示猪肉新鲜度

综合3 种指示膜的性能，SPR膜的颜色稳定性最优且具有良好的机械性能，因此最终选取SP溶液为基底材料制备指示膜，用于指示猪肉新鲜度。由图6B可以看出，随着贮藏时间的延长，TVB-N值和ΔE值均在增加。TVB-N的初始值为5.52 mg/100 g，72 h后TVB-N的值达到了41.60 mg/100 g，ΔE增加到30.94。图6A中指示膜颜色也有明显的变化，从开始的粉红色到最后的浅黄色。在贮藏初期，随着贮藏时间延长，TVB-N值的增量少且平缓，在24 h时的TVB-N值为11.28 mg/100 g，根据GB 2707—2016《鲜（冻）畜肉卫生标准》规定每100 g新鲜猪肉中TVB-N值应小于15 mg[29]，可判断肉仍处于新鲜期。当肉的贮藏时间达到36 h后，TVB-N值增至15.69 mg/100 g，此时超过国标规定的TVB-N值，猪肉呈不新鲜状态，ΔE的值为15.06，处于人眼可以明显感知的色彩变化的范围[30]，指示膜的颜色从肉眼可见的暗红色变为淡紫色。在贮藏后期60 h时，TVB-N的值达到30.78 mg/100 g且ΔE的值增至29.61，指示膜的颜色变成褐色，此时肉已经完全腐败。整个贮藏过程中，指示膜的颜色变化与猪肉品质信息关系密切，且可以被肉眼明显区别。因此，玫瑰茄花青素制备的指示膜可用于实时检测肉类新鲜度。

图6 猪肉贮藏期间TVB-N值的变化和指示膜的色差Fig. 6 Change in TVB-N value of pork samples during storage and the corresponding change in Δ E

3 结 论

本研究利用天然玫瑰茄花青素提取物结合可降解材料制备智能指示膜。玫瑰茄花青素提取物在不同pH值环境下呈现不同的颜色，酸性环境中为红色，碱性环境中为蓝色。本实验制备了CSR膜、CPR膜、SPR膜，比较分析了3 种复合膜的FT-IR光谱、机械性能、微观结构、颜色稳定性。FT-IR光谱和扫描电子显微镜图表明复合膜的各种组分之间相容性良好；SPR膜的EB最大，含水率最低而水蒸汽透过率最高；比较分析指示膜的微观结构，发现CPR膜和SPR膜截面之间均比较光滑，结构紧密，相容性高；研究指示膜的颜色稳定性，发现SPR膜在贮藏16 d的颜色变化率不超过4%。将SPR膜用于猪肉新鲜度的检测，当肉的贮藏时间达到36 h后，TVB-N值为15.69 mg/100 g，猪肉呈不新鲜状态，ΔE的值为15.06，指示膜的颜色由红变蓝。结果表明玫瑰茄花青素提取物是智能指示膜的理想原料，可用于开发指示肉类食品新鲜度的智能包装，其中SP更有利于开发更稳定的智能指示膜，具有良好的应用潜力。

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Development of Intelligent Indicator Films Based on Roselle Anthocyanins for Monitoring Pork Freshness

ZOU Xiaobo, ZHANG Junjun, SHI Jiyong, JIANG Caiping, ZHAI Xiaodong, WANG Sheng, ZHAO Hao, LIANG Nini
(Agricultural Product Processing and Storage Laboratory, School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University,Zhenjiang 212013, China)

Intelligent indicator fi lms based on natural anthocyanins from roselle were developed for real-time monitoring of pork freshness. Three kinds of composite fi lms were prepared by using binary combinations of starch, chitosan and polyvinyl alcohol as the solid substrate. The mechanical properties, water content, microstructure and color stability of the composite films were characterized and compared. The results showed that the chitosan/polyvinyl alcohol/roselle anthocyanins composite fi lm had the highest tensile strength (98.28 MPa), and the starch/polyvinyl alcohol/roselle anthocyanins (SPR)composite fi lm had the highest elongation at break (88.16%), lowest water content and greatest color stability. Scanning electron microscopic photographs showed that the composite films had different microstructures. Finally, the SPR film was selected to indicate the freshness of pork stored at 25 ℃. Total volatile basic nitrogen (TVB-N) value of pork samples increased over time. In particular at 36 h, the TVB-N value was higher than 15 mg/100 g, indicating the occurrence of pork spoilage. Accordingly, the color of the SPR composite fi lm changed into mauve and eventually into brown (at 60 h) with the increase of TVB-N. Overall, these results can help develop intelligent indicator fi lms for monitoring pork freshness.

indicator fi lms; pork; freshness; roselle anthocyanins; starch; chitosan; polyvinyl alcohol

10.7506/spkx1002-6630-201723039

TS206.4

A

1002-6630（2017）23-0243-06

邹小波, 张俊俊, 石吉勇, 等. 基于玫瑰茄花青素的猪肉新鲜度智能指示膜研究[J]. 食品科学, 2017, 38(23): 243-248.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723039. http://www.spkx.net.cn

ZOU Xiaobo, ZHANG Junjun, SHI Jiyong, et al. Development of intelligent indicator fi lms based on roselle anthocyanins for monitoring pork freshness[J]. Food Science, 2017, 38(23): 243-248. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723039. http://www.spkx.net.cn

2017-09-12

“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD17B04）；“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0401104）；国家自然科学基金面上项目（31671844）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31601543）；中国博士后科学基金项目（2014T70483；2016M590422；2017T100334）；

江苏省自然科学基金项目（BK20160506；BE2016306）；江苏省国际科技合作项目（BZ2016013）；

苏州科技发展项目（SNG201503）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；

江苏省研究生科研创新计划项目（KYCX17_1798）；江苏省大学生创新创业训练计划项目（5551360009；5551360022）

邹小波（1974—），男，教授，博士，研究方向为食品无损检测。E-mail：zou_xiaobo@ujs.edu.cn