微小RNA21和TGF—β1在正常皮肤和增生性瘢痕组织中的表达研究

地里夏提·库尔班

[摘要]目的：探讨微小RNA-21（miRNA-21）基因与转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）基因在正常皮膚组织和增生性瘢痕组织中的表达，并分析其相关性。方法：选取本院烧伤整形科收治的16例烧伤整形患者的增生性瘢痕组织及其临近的正常皮肤组织，提取组织中的总RNA，采用实时荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）技术分别检测增生性瘢痕组织和正常组织中miRNA-21与TGF-β1基因表达量，对检测结果进行分析比较，并行相关性分析。结果：增生性瘢痕组织中miRNA-21基因表达明显上调，差异具有统计学意义（P<0.05），其表达水平是正常皮肤组织的2.18倍；增生性瘢痕中TGF-β1的表达量多于正常皮肤组织，差异具有统计学意义（P<0.05），其表达水平是正常皮肤组织的2.31倍；增生性瘢痕组织中miRNA21基因表达量与TGF-β1基因表达量呈正相关（r=0.836，P<0.01）。结论：增生性瘢痕组织中miRNA-21和TGF-β1基因表达异常，可能与瘢痕组织形成相关。

[关键词]增生性瘢痕；微小RNA21；TGF-β1

[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）10-0068-03

Abstract： Objective To investigate the expression of microRNA-21 （miRNA-21） gene and transforming growth factor-β（TGF-β1） gene in normal skin and hypertrophic scar tissue， and to analyze its correlation. Methods Collected from 16 hypertrophic scar tissues and adjacent normal skin tissues formed by burn and plastic surgery department in our hospital， total RNA was extracted from normal tissues and Hypertrophic scar tissue. The expressions of miRNA-21 and TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue and normal tissue were detected by RT-qPCR. The detection results were analyzed and compared， and the correlation analysis was carried out. Results The expression of miRNA-21 gene in hypertrophic scar tissue was significantly up-regulated， the difference was statistically significant（P<0.05）， its expression level was 2.18 times of normal skin tissue. The expression of TGF-β1 in hypertrophic scar was higher than that in normal skin tissue（P<0.05）. The expression level of TGF-β1 was 2.31 times higher than that of normal skin tissue. There was a positive correlation between the expression of miRNA-21 gene and the expression of TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue（r=0.836， P<0.01）. Conclusion The abnormal expression of miRNA-21 and TGF-β1 gene in hypertrophic scar tissue may be related to the formation of scar tissue.

Key words： hypertrophic scar； microRNA-21； TGF-β1

增生性瘢痕是伤口表皮愈合过程中组织过度增生而引起的病理性瘢痕，不具备正常皮肤结构和生理功能。严重创伤、烧伤及外科手术后常并发程度不等的增生性瘢痕，影响外貌美观，甚至可导致严重畸形及功能障碍，降低患者生活质量。具体发病机制尚未完全明确。但有研究表明，增生性瘢痕主要与成纤维细胞异常增殖及凋亡抑制、分泌和释放的正向及负向细胞因子调节机制的异常，以及细胞外基质胶原合成与降解的失平衡有关，包括整合素、TGF-β和miRNA的异常表达[1-2]。在增生性瘢痕与正常皮肤组织微小RNA芯片及基因芯片检测研究中发现，miRNA-21和TGF-β1在增生性瘢痕与正常皮肤组织中存在差异表达，可能与增生性瘢痕组织的发生、发展及演化密切相关[3]。但关于miRNA-21与TGF-β1基因在增生性瘢痕形成过程中是否起协同作用，目前相关研究报道尚罕见。且以往关于TGF-β1的研究多局限于免疫组化、原位杂交或半定量水平的研究。本研究通过荧光定量PCR法测定增生性瘢痕组织和正常组织中miRNA-21与TGF-β1的基因表达水平，了解miRNA-21与TGF-β1在增生性瘢痕组织与正常组织中的表达差异，分析两者与增生性瘢痕组织病理发展的相关性。endprint

1 材料和方法

1.1 标本来源：收集本院2016年1月到2017年5月收治的16例燒伤整形患者术中切取的增生性瘢痕组织和临近正常皮肤组织。其中男9例，女7例，年龄18～60岁；致伤部位：颌面部6例，上臂4例，膝关节2例，大腿4例；瘢痕面积：4.0cm×3.0cm～6.0cm×5.5cm。纳入标准：①瘢痕增生时间为9～18个月，局部皮肤色泽鲜红，质地较硬；②发病后未长时间服用瘢痕增生抑制药物，包括放射或注射治疗；③无全身系统性纤维化、肿瘤等病史，术前1个月内未使用激素类药物；④患者均知情同意，自愿签署知情同意书。本次研究获得本院医学伦理委员会批准同意。

1.2 试剂：Trizol试剂购自日本Takara公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自日本Takara公司；微小RNA分离试剂购自ABI公司；实时定量RT-qPCR仪购自美国ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA制备：从液氮中取出标本约100mg，用移液器吸取1ml Trizol溶液加入到组织中，于冰上研磨搅匀，后续RNA提取步骤参照Trizol试剂盒说明。总RNA在紫外分光光度计上检测260nm、280nm波长处的吸光度（A）值，并计算A260/A280比值，采用1.8～2.0者进行下一步实验操作。cDNA的合成严格按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行，将产物cDNA冻存于-80℃备用。

1.3.2 RT-qPCR检测mRNA表达水平：采用美国ABI公司RT-PCR仪检测mRNA表达水平。建立总体积20μl反应体系：包括10μl SYBR荧光（定量）染料，2μl cDNA，0.4μl ROX 染料，7.1μl ddH2O，上下游引物各为0.25μl，引物序列见表1。定量PCR的反应条件：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。结果以每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数用Ct值表示。每份标本均作复孔，反应结束后作熔解曲线。ΔCt=目的基因Ct值-减去内参Ct值，2-ΔΔCt值表示目的基因mRNA表达水平的高低。

1.4 统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件分析实验数据，以均数±标准差（x?±s）表示miRNA-21与TGF-β1 mRNA表达水平，行配对t检验，变量间相关关系采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-21基因表达量测定结果：增生性瘢痕组织中miRNA-21的2-ΔΔCt值为2.88±0.15，正常皮肤组织miRNA-21的2-ΔΔCt值为1.32±0.23，表明增生性瘢痕组织中miRNA-21的表达量高于正常皮肤组织，差异有统计学意义（t=3.12，P=0.03）；且增生性瘢痕组织与正常皮肤的miRNA-21比值为2.18，表明增生性瘢痕组织中miRNA-21基因表达量是正常皮肤组织的2.18倍。见表2。

2.2 TGF-β1基因表达量测定结果：增生性瘢痕组织TGF-β1的2-ΔΔCt值为0.827±0.085，正常皮肤组织TGF-β1的2-ΔΔCt值为0.357±0.079，表明增生性瘢痕组织中TGF-β1的表达量高于正常皮肤组织，差异有统计学意义（t=2.17，P=0.04）；增生性瘢痕组织与正常皮肤的TGF-β1比值为2.31，表明增生性瘢痕组织中TGF-β1基因表达量是正常皮肤组织的2.31倍。见表2。

2.3 增生性瘢痕组织中miRNA-21和TGF-β1的关系：增生性瘢痕组织中miRNA-21基因表达量与TGF-β1基因表达量呈正相关（r=0.836，P<0.01）。

3 讨论

曾有研究报道，增生性瘢痕与miRNA的异常表达密切相关[4]。通过对人增生性瘢痕组织中miRNA表达谱进行研究，发现其中一部分miRNA表达与正常皮肤组织中存在显著差异，其中miRNA-21表达差异较明显，且较多研究已证实miRNA-21在增生性瘢痕组织中表达异常高于正常组织[5]。相关动物实验结果表明，miRNA-21拮抗剂可以显著减少增生性瘢痕的瘢痕面积和瘢痕厚度[6]。miRNA-21广泛存在于植物、线虫和人类细胞中，其作为内源性调控性RNA，通过基因调节参与生命中的重要进程，如早期胚胎发生、细胞增殖、细胞生存及凋亡、细胞代谢、能量平衡等[7-8]，在肿瘤、增生性瘢痕形成与发展中也发挥着重要作用[9-10]。细胞核内miRNA-21是由RNA多聚酶Ⅱ、Ⅲ催化转录生成初始微小RNA，再经核酸Dicer酶加工成前体miRNA，然后被转运到细胞质经Dicer酶剪切为成熟的miRNA-21。成熟miRNA-21的单链可以选择性结合RNA，诱导沉默复合体生成，结合靶基因，导致靶基因mRNA裂解或抑制靶基因蛋白翻译，参与转录后基因和蛋白表达水平调节[11]。本次研究结果显示，miRNA-21在增生性瘢痕组织中的表达显著高于正常皮肤组织，即miRNA-21在人增生性瘢痕中表达上调，其表达量是正常皮肤组织的2.18倍。miRNA-21作为一种可调控基因表达的内源性小分子RNA，可能通过调节增生性瘢痕的靶基因或蛋白来影响细胞的发育、增殖、分化、凋亡等过程。这与胡洋红等研究结论基本一致[12]，即miRNA-21在增生性瘢痕与正常皮肤组织中存在差异表达，且增生性瘢痕组织中表达显著高于正常皮肤组织。

皮肤真皮层是由大量作为支架的细胞外基质及少量细胞、表皮等构成。其中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维是细胞外基质的重要组成部分，增生性瘢痕组织主要是由机体修复细胞——成纤维细胞，在创伤修复时，大量合成Ⅰ型胶原而形成。TGF-β1参与创面修复的各个阶段和瘢痕形成期[13-14]。研究表明，TGF-β1可通过激活转移生长因子β激化激酶（transforming growth factor-beta-activated kinase 1，TAK1），启动下游一系列的信号反应，主要包括细胞凋亡、周期调控、细胞分化、纤维化、纤维疾病的病理生理过程[15-16]。本研究发现，TGF-β1在增生性瘢痕组织表达显著高于正常皮肤组织，且增生性瘢痕组织中TGF-β1基因表达量是正常皮肤组织的2.31倍。而近年来研究表明，TGF-β1在增生性瘢痕组织中表达显著高于正常皮肤组织[3，17]，这与本研究结果一致。endprint

通过对增生性瘢痕组织中miRNA-21和TGF-β1的表达量进行相关性分析发现，增生性瘢痕组织中miRNA-21基因表达量与TGF-β1基因表达量呈正相关。miRNA-21可能通过调节TGF-β1而在增生性瘢痕组织中发挥作用。最近的研究发现TGF-β1诱导成纤维细胞增生，导致miRNA-21表达量增加，加速纤维化进程，促使增生性瘢痕组织形成，这也与本研究结论基本一致[18]。有研究发现，miRNA-21还可以通过调节TGF-β-Smad信号转导通路促进间质干细胞向成脂细胞分化和抑制人脂肪源干细胞增殖，推测也可能通过次信号通路参与增生性瘢痕组织的形成和发展过程[19]。

综上，增生性瘢痕组织中miRNA-21与TGF-β1基因表达量异常，显著高于正常皮肤组织，可能与瘢痕组织形成相关。但其具体机制尚需在成纤维细胞中进行miRNA21的沉默表达实验加以完善。

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[收稿日期]2017-08-21 [修回日期]2017-09-04

编辑/朱婉蓉endprint