不同清创法对开放性创口早期感染敏感指标影响的实验研究

卢 冰，赵婵娟，钟振东

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院骨科，四川 成都 610072；2.四川大学华西第二医院，四川 成都 610041)

不同清创法对开放性创口早期感染敏感指标影响的实验研究

卢 冰1，赵婵娟2，钟振东1

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院骨科，四川 成都 610072；2.四川大学华西第二医院，四川 成都 610041)

目的探讨不同清创法对开放性创口早期感染敏感指标的影响。方法将96只SD大鼠随机分为8组，除正常组外，各组用无菌手术法切除皮肤，去掉皮下组织和部分肌肉，造成基底凹凸不平的创面，将大肠杆菌悬浊液(细菌数>1×109个/ml) 1 ml 均匀涂于各伤口表面，使局部细菌数>1×107个。对照组伤口不予冲洗，其余各组分别用肥皂水和生理盐水处理。分别采集1、3、7d的标本检测，通过ELISA、QRT-PCR和Western blot技术，观察感染的发生、发展、预后与免疫因子血清降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和脂联素(APN)之间的动态变化，比较各组对开放性创口早期感染敏感指标的影响。结果与正常组比较，对照组PCT、TNF-α水平同时升高，APN水平降低。各高低压处理组均能不同程度降低PCT、TNF-α水平，升高APN水平(P< 0.01)，且高压肥皂水冲洗组和高压生理盐水冲洗组术后切口早期感染发生率低于低压肥皂水和低压生理盐水组(P< 0.05)。传统冲洗方式组作用7d后PCT、TNF-α和APN的水平差异无统计学意义(P> 0.05)。结论对于开放性创口早期感染敏感指标的影响，改良冲洗的清创方式预防术后感染效果优于传统倒水法的清创方式。

清创；开放性创口；早期感染；PCT；TNF-α；APN

全球每年因创伤致死者约200余万人，伤数千万人[1]，其中，部分外伤会破坏皮肤的完整性，如软组织、肌肉撕裂或挫伤，这种开放性、复杂性的骨外伤多半会伴随感染风险，继而导致伤口或骨折的延迟愈合，严重者甚至会因为脓毒血症导致死亡[2]。因此，开放性损伤被骨外科认为是最需要紧急处理的。开放性损伤初期处理最重要的就是彻底的冲洗清创[3]，多项资料表明单一的冲洗方式可以在一定程度上减少伤口感染率[4]，但效果并不满意。多数研究仅是对单项指标的评价，缺乏对综合多项指标的观察，难以为选择合理的冲洗液及冲洗压力提供临床指导。本研究通过大鼠开放性创伤实验造模，采用不同冲洗液和冲洗压力结合的改良方式与传统冲洗方式对比，探讨清创方式对控制开放性创伤感染的有效作用。部分研究表明免疫因子与感染的早期诊断和预后有密切的关系[5～7]。2015～2017年我院采用ELISA、QRT-PCR和Western blot技术，观察感染的发生、发展、预后与免疫因子血清降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和脂联素(APN)的动态变化，从而为感染早期如何合理有效的选择清创方式，选取正确的敏感指标和检验方式提供有利的实验证明，为临床早期把握感染征象，防止疾病的恶化，改善患者预后提供前期实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物SD大鼠96只，SPF级，雌性，体重300～400 g，单笼饲养，重庆第三军医大提供，许可证号SCXK(渝)2012-0005，每天光照与黑暗时间各12 h，动物房温度和湿度分别设置在20～22°C和40%～50%。所用笼具、饲料、垫料、饮水均高压灭菌，实验期间的灌胃、换水、添加饲料等操作均在超净工作台内进行，由专人管理。

1.2药物与试剂肥皂液每500 ml生理盐水包中溶解15 ml肥皂；生理盐水500 ml；冲洗器(Pulsavac，Zimmer，Dover，OH)；大肠杆菌悬浊液(细菌数>1×109个/ml)；双蒸水；水合氯醛为分析纯(批号20150513)；Total RNA 提取试剂(RNAiso Plus)；RT Master Mix 逆转录试剂盒(日本 TAKARA 公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物技术公司)；兔抗鼠 SHP 抗体(美国Bioworld公司)；ELISA 试剂盒(批号 201602，上海江莱试剂有限公司)；Stratagene荧光定量 PCR 仪(Mx3000P，美国 Agilent 公司)；Abbott(雅培)Aeroset全自动生化分析仪(美国雅培制药有限公司)；聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳仪和电转仪(美国 Bio-Rad 公司)。

1.3方法

1.3.1实验分组及造模 SD大鼠分为正常组、对照组、肥皂水组、高压肥皂水冲洗组、低压肥皂水冲洗组(高压组用40psi，低压组用14psi)、生理盐水组、高压生理盐水冲洗组和低压生理盐水冲洗组各12只。用电推剪及电剃须刀去除腹部毛发，面积约2 cm×3 cm，常规消毒后用无菌手术法切除皮肤，去掉皮下组织和部分肌肉，造成基底凹凸不平的创面，最深处可达骨膜外层。用大肠杆菌作为污染创面的细菌。将大肠杆菌悬浊液1 ml 均匀涂于各伤口表面，使局部细菌数>1×107个。

1.3.2标本采集 分别取各组冲洗后创伤中心部位组织2块约 1 cm×1 cm×1 cm，装于EP管中，放置液氮中快速冷冻，然后转移至-80 ℃超低温冰箱冻存待做RT-PCR和Western blot。分别于实验后第1、3、7天按照设计的顺序进行断尾取血，每次使用血清管(美国BD公司)取血约0.8 ml，3000转/分离心10分钟，取上清液血清约0.2 ml。

1.3.3检测指标 ①血清PCT、TNF-α和APN水平。采用放射免疫测定法测定血清PCT、TNF-α和APN的值，步骤按PCT、TNF-α和APN试剂盒说明进行。②皮肤组织PCT、TNF-α和APN mRNA水平。Trizol法提取大鼠皮肤总RNA，分光光度法测定260 nm与280 nm的OD值，用OD260/OD280估计RNA纯度(2.0左右即为RNA纯品)。按试剂盒说明进行反转录和RT-PCR扩增，RT-PCR数据收集由7.0 System SDS Software软件完成，通过软件计算所有样品的CT值，以相应内参照基因进行校准，采用2-△△CT方法对各基因表达进行相对定量：△CT=CT(target)-CT(ref)；Avg。△CT(calibrator)=Avg。CT(target，calibrator)-Avg。CT(ref，calibrator)；△△CT=△CT-Avg。△Ct(calibrator)；2-△△CT表示通过参照基因校准的PCT m RNA、TNF-αmRNA、APN mRNA的相对表达水平。③皮肤PCT、TNF-α和APN蛋白表达。取各组大鼠冰冻皮肤组织约100 mg，剪碎后放入1 ml RIPA 裂解液中，加入PMSF10 μl，冰上匀浆后静置30 min，4 ℃离心12000 r/min，20 min，取上清液，BCA 法测定待测样品的总蛋白浓度。每孔上样量为 40 μg蛋白配置为10 μl上样体系，SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上层5%浓缩胶，下层12%分离胶。电泳后采用 Bio-Rad Mini Trans-Blot转移系统PVDF膜转膜，5%蛋白封闭液封闭2.5 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗结合，4 ℃过夜；TBST 洗膜10 min×3次，二抗常温浸泡1.5 h，ECL化学发光显色，Bio-Rad CCD 成像系统获取图像。

1.4统计学方法采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，正态分布数据比较采用t检验，非正态分布数据比较采用秩和检验，多组间比较采用方差分析，方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Tamhane’sT2检验；计数资料比较采用卡方检验；单向有序等级资料比较采用秩和检验或Ridit分析。P< 0.05为差异有统计学意义，P< 0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1实验第1d血清PCT、TNF-α和APN的水平

从表1可知，实验第1d，与正常组比较，对照组PCT、TNF-α细胞因子的水平均显著升高(P< 0.05)，APN细胞因子水平显著降低(P< 0.05)；与对照组比较，高压肥皂水冲洗组、高压生理盐水冲洗组和低压肥皂水冲洗组、低压生理盐水冲洗组PCT、TNF-α细胞因子的水平均显著降低P< 0.05)，APN细胞因子的水平显著升高(P< 0.05 )。

表1 实验第1d各组大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*与对照组比较，P< 0.05；△与肥皂水组比较，P< 0.05；▲与生理盐水组比较，P< 0.05

2.2实验第3d血清PCT、TNF-α和APN的水平

从表2可知，实验第3d，与正常组比较，对照组PCT、TNF-α细胞因子的水平均显著升高(P< 0.05)，APN细胞因子水平显著降低(P< 0.05)；与对照组比较，高压肥皂水冲洗组、高压生理盐水冲洗组和低压肥皂水冲洗组、低压生理盐水冲洗组PCT、TNF-α细胞因子的水平均显著降低P< 0.05)，APN细胞因子的水平显著升高(P< 0.05 )。

表2 实验第3d各组大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*与对照组比较，P< 0.05；△与肥皂水组比较，P< 0.05；▲与生理盐水组比较，P< 0.05

2.3实验第3d血清PCT、TNF-α和APN的水平从表3可知，实验第7d，与正常组比较，对照组PCT、TNF-α细胞因子的水平均显著升高(P< 0.05)，APN细胞因子水平显著降低(P< 0.05)；与对照组比较，高压肥皂水冲洗组、高压生理盐水冲洗组和低压肥皂水冲洗组、低压生理盐水冲洗组PCT、TNF-α细胞因子的水平均显著降低P< 0.05)，APN细胞因子的水平显著升高(P< 0.05 )。

表3 实验第7d各组大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*与对照组比较，P< 0.05；△与肥皂水组比较，P< 0.05；▲与生理盐水组比较，P< 0.05

2.4大鼠皮肤组织PCT、TNF-α和APNmRNA的表达从表4可知，与正常组比较，对照组PCT、TNF-α mRNA的水平均明显上调(P< 0.05)，APN mRNA的水平明显下调(P< 0.05)；与对照组比较，高压肥皂水冲洗组、高压生理盐水冲洗组和低压肥皂水冲洗组、低压生理盐水组作用7d后PCT、TNF-αmRNA的水平均明显下调(P< 0.05)，APN mRNA的水平明显上调(P< 0.05 )。

表4 各实验组大鼠PCT、TNF-α和APNmRNA水平 (2-△△CT)

*与对照组比较，P< 0.05；△与肥皂水组比较，P< 0.05；▲与生理盐水组比较，P< 0.05

2.5皮肤组织中PCT、TNF-α和APN蛋白的表达从表5可知，与正常组比较，对照组PCT、TNF-α mRNA的水平均明显上调(P< 0.05)，APN mRNA的水平明显下调(P< 0.05)；与对照组比较，高压肥皂水冲洗组、高压生理盐水冲洗组和低压肥皂水冲洗组、低压生理盐水组作用7d后PCT、TNF-αmRNA的水平均明显下调(P< 0.05)，APN mRNA的水平明显上调(P< 0.05 )。

表5 各实验组大鼠PCT、TNF-α和APN蛋白水平 (2-△△CT)

*与对照组比较，P< 0.05；△与肥皂水组比较，P< 0.05；▲与生理盐水组比较，P< 0.05

3 讨论

开放性创伤患者常常并发全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症及多器官功能障碍综合征(MODS)，其中脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，是创伤患者重要的死亡原因之一。探讨开放性创伤的感染早期敏感指标并找到合理的清创模式，及时检查出并发感染的可能，降低感染率，促进创面修复以及阻止疾病的恶化已成为外科医生关注的重点。因此，实验中设计将压力与冲洗液的选择进行不同搭配组合，通过对感染指标的检验，找到最符合临床需要的改良冲洗方式，在开放性损伤的初期就极大降低感染率。

PCT由116个氨基酸残基组成，相对分子质量约13000，由特异蛋白酶将其剪切为降钙素、降钙蛋白和N2末端残基，是降钙素的前体物质[8]。正常情况下甲状腺C细胞生成分泌前降钙素，而在其他器官组织如肝脏、肺脏、肾脏、睾丸及神经内分泌细胞和单核细胞都有PCT-I和PCT-II mRNA的表达[9]。研究认为PCT可作为细菌早期感染的标志物及预后指标，PCT水平与炎症进展相关，PCT水平持续升高提示感染源持续存在，预后不良，经有效治疗24 h后PCT水平下降，表明治疗有效，动态观察PCT水平变化可以监测病情变化[10]。研究表明[11]，PCT可用于鉴别细菌及非细菌感染，也可用于明确发热患者的病因，在自身免疫性疾病引起的发热患者中，不伴细菌感染时，PCT水平在正常水平，当伴细菌感染时，PCT不同水平升高，而其它炎症因子不论在伴不伴发感染时均升高。

TNF-α被认为是介导内毒素损伤效应的关键介质之一，过量的TNF不仅自身激活直接作用于各器官、组织、细胞诱导损伤，而且可诱导产生其他细胞因子如白细胞介素6(IL-6)，使TNF-α的生物学效应进一步放大，而引发了一系列细胞因子级联反应，刺激产生一系列有害物质[12]，对机体造成继发性损伤[13，14]，是反映机体炎症与组织损伤严重程度的重要敏感指标[15]。有学者认为严重创伤发生后，血液中炎性细胞因子相继升高，TNF最早出现，并迅速达到高峰，在MODS发生、发展的整个过程中起了关键的核心作用[16]。临床研究发现TNF不仅可早期预测外伤后MODS的发生，而且可以作为预测预后的标志物，如患者血浆TNF持续高水平存在，则患者发展成MODS以致死亡的可能性很大，从而可帮助判断预后[17]。

APN是一种由已知Acrp30、AdipQ、apM1和GBP28基因决定、脂肪细胞分泌的内源性生物活性蛋白质，由Scherer等[18]于1995年在小鼠3 T3-L1前脂肪细胞系的分化过程中分离克隆发现。有研究发现低APN水平可能具有抑制巨噬细胞活性、抗炎症反应等作用，并促进血液循环中炎性因子如TNF、IL-6等分泌增加[19]。有研究结果证实[20]：在内毒素(LPS)诱发的大鼠脓毒血症模型中，血浆APN浓度在注射LPS后4 h就开始出现下降，到24 h时降至约为正常对照组的50%。而脂肪组织中APN表达水平于注射LPS后24 h也显著降低。通过相关分析发现：脂肪组织中APNmRNA表达水平与血浆APN水平具有高度相关性。这说明在脓毒症等急性炎症反应中也会出现低APN血症，机体APN浓度的高低与脓毒症的发生与发展有关。血清APN水平降低可能是脓毒症发生发展的重要因素，其机制可能与降低APN对脓毒症患者炎症反应的抑制作用有关，提示APN水平是反映脓毒症病情及评价预后的一项重要参考指标。

目前研究表明，感染的发生以及预后好坏与PCT密切相关，感染发生后，机体中PCT和TNF会同时升高，这点通过本实验也得到了证实；同时，实验研究中发现APN与TNF在感染发生的过程中呈负相关关系，但它能否直接调节LPS诱导的炎症因子(PCT、TNF)的产生以及起到调节机制，目前并不清楚，有待于进一步的深入探讨。本实验中设计在感染早期就检测PCT、TNF、APN三项指标，探究了各类炎症因子在感染早期的相互作用以及不同检验方式中的表达，从而可以帮助临床诊疗过程中更早的发现早期感染征象，同时又节约医疗资源地把握软组织感染及坏死的发生发展进程。

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Experimentalstudyontheeffectofimproveddebridementmethodonsensitivemarkersforearlyinfectionofopenwound

LUbing1，ZHAOChan-juan2，ZHONGZhen-dong

(1.SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China；2.WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

ZHAOChan-juan

ObjectiveTo evaluate the effect of improved debridement method on sensitive markers for early infection of open wound.MethodsNinety-six SD rats were divided into 8 groups.Except for the normal group，the skin of each group was removed by sterile operation.Moreover，the subcutaneous tissue and part of the muscle were removed to make the uneven wound surface.One ml of Escherichia coli suspension (bacteria count >1 × 109/ml) was evenly placed on the surface of the wound in which the local number of bacteria was larger than 1 × 107.The wounds in the control group were not washed，and the rest groups were treated with soap water and physiological saline for 1 day，3 days and 7 days.The specimens were collected respectively.The positive and negative expression of APN，TNF-α and PCT were determined in the occurrence，development，prognosis of infection by using ELISA，QRT-PCR and Western blot techniques.The effects of improved debridement method on sensitive markers for early infection of open wound were compared.ResultsCompared to the normal group，the levels of TNF-α and PCT in the control group were increased and the level of APN was decreased.The levels of TNF and PCT were decreased in the high and low pressure treatment group and the level of APN was increased (P< 0.01).Furthermore，the incidence of early postoperative infection was lower in the high-pressure soap water washing group and the high-pressure saline group than that in the low-pressure soap water and the low-pressure physiological saline group (P< 0.05).After 7 days，there was no significant difference in the level of PCT，TNF-α and APN in the traditional washing method group (P> 0.05).ConclusionFor effect of open wound infection on early sensitive index，improved washing debridement method is better than traditional method for prevention of postoperative infection.

Debridement；Open Wound；Early Infection；PCT；TNF-α；APN

赵婵娟

R641

A

1672-6170(2017)06-0071-05

2017-03-21；

2017-05-23)