维生素D 与COPD患者下呼吸道细菌定植及痰相关炎症因子关系的研究

王慎临，杨 朝，张丽萍

·论 著·

维生素D与COPD患者下呼吸道细菌定植及痰相关炎症因子关系的研究

王慎临，杨 朝，张丽萍

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期患者维生素D缺乏与下呼吸道细菌定植及痰相关炎症因子的相关性。方法筛选COPD稳定期患者96例，抽静脉血采用电化学方法测定血清25羟基维生素D水平，留取深部痰液进行细菌定量培养(分为定植组和无定植组)，醇联免疫吸附法(ELSA)测定痰液上清液中白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，分析2组患者血清25羟基维生素D水平及痰液上清中IL-8、TNF-α水平的差异及相关性。结果96例COPD稳定期患者存在下呼吸道细菌定植者有37例，占38.54%。定植组患者血清25羟基维生素D水平明显低于无定植组，定植组患者痰液上清中IL-8、TNF-α水平明显高于无定植组(P<0.05)。2组患者血清25羟基维生素D水平与痰液上清中IL-8、TNF-α水平呈负相关。结论COPD稳定期患者维生素D缺乏容易出现下呼吸道细菌定植，维生素D水平与IL-8、TNF-α水平呈负相关。

慢性阻塞性肺疾病;25羟基维生素D;细菌定植;白介素-8;肿瘤坏死因子-α

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种气流受限、不完全可逆、呈进行性发展的疾病，是最常见的呼吸系统疾病之一，居当前死亡原因第四位，每年因高碳酸血症恶化住院的患者院内死亡率约为10%，社会经济负担重。有研究证实，50%的COPD急性发作是由细菌引起的[1]，常见的细菌有流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌等。COPD稳定期下呼吸道细菌的定植与气道炎症、频紧的症状发作和急性加重风险有关[2]。另一项研究显示与无定植COPD患者相比，流感嗜血杆菌定植的COPD稳定期患者，存在更多的气道炎症反应[3]。针对细菌定植的情况，仍需要避免长期使用抗生素治疗，因为会导致定植菌株的多重耐药。维生素D有免疫调节作用，研究显示25羟基维生素D水平缺乏与呼吸道感染、住院肺炎患者死亡率相关[4-5]。那么，维生素D缺乏是不是COPD稳定期患者细菌定植的危险因素呢？维生素D与COPD稳定期患者痰炎性因子的相关性研究国内尚未报道。本研究通过比较COPD稳定期患者细菌定植组和无定植组血清25羟基维生素D水平的差异，以及研究血清25羟基维生素D与痰炎性因子白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的相关性，探讨维生素D缺乏与COPD稳定期患者细菌定植的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2015年10月-2016年3月在宁夏人民医院呼吸内科门诊就诊的慢性阻塞性肺疾病稳定期患者96例，其中男性57例，女性39例，平均年龄(65±14.7)岁，均符合纳入标准，签署受试者知情同意书。纳入标准：①符合GOLD(2007版)慢性阻塞性肺疾病稳定期诊断标准[6]。②既往6周无急性加重症状，无普通感冒及其他呼吸道感染性疾病。③近4周未使用抗生素。排除标准：①排除影响维生素D水平的疾病：支气管哮喘、肺结核、肿瘤、糖尿病、甲状腺疾病、免疫系统疾病。②近半年内曾补充维生素D治疗。③半年内可能影响维生素D水平的药物史，如苯巴比妥、苯妥英钠。下呼吸道定植菌的诊断标准[7]参照气管切开患者下呼吸道定植菌的病原学研究。

1.2 痰液标本留取及培养:受试者清水漱口，先自行咳痰；若无痰，予0.9%氯化钠溶液雾化吸入排痰；若仍无痰，再逐步予3%、4%、5%氯化钠溶液雾化吸入排痰，每次间隔7 min，直至留取痰液约10 mL。取痰过程中若出现不适如喘憋、气短、呼吸困难等，立即停止雾化吸入，休息、吸氧，吸入β2受体激动剂(沙丁胺醇)。研究证实稳定期中、重度COPD患者吸入高渗盐水进行痰的诱导是安全的[8]，对进行诱导痰的患者需签署知情同意书。将诱导痰液置入无菌的痰盒中，镜下观察痰液标本是否合格。痰液合格标准： 每低倍视野鳞状上皮细胞<10个、多核白细胞>25个，或二者比例<1∶2.5，不合格标本立即重新留取痰液标本。之后以合格痰液标本分别接种于血平板、巧克力平板、中国蓝平板进行细菌培养，应用常规方法分离、鉴定细菌。细菌定量≥107CFU/mL者判定为阳性。

1.3 痰液细胞因子检测:将原痰液标本(≥5 mL)用微量秤称重，加4倍体积的新鲜配制的0.11%二硫苏糖醇用吹管反复吹打，用振荡器震荡旋转15 min，使之成为均匀的悬混液，将悬混液以48 μm的滤网过滤，再将过滤的混悬液放入离心机以790 g离心10 min，上清液分装后-80 ℃保存，采用双抗体夹心法检测痰液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)。

1.4 维生素D水平的检测:由于25羟基维生素D半衰期较长，可以稳定反映体内维生素D水平，故选择25羟基维生素D作为检测指标，采用ELISA法测定25-(OH)D浓度。

2 结果

2.1 COPD稳定期患者下呼吸道细菌定植情况:96例COPD患者均完成诱导痰检测，合格痰液标本分别接种于血平板、巧克力平板、中国蓝平板进行细菌培养，应用常规方法分离、鉴定细菌。痰液标本阳性者37例，占38.5%，其中流感嗜血杆菌阳性率为13.5%(13例)，肺炎链球菌阳性率为12.5% (12例)，副流感嗜血杆菌阳性率为7.3% (7例)，铜绿假单胞菌阳性率为3.1% (3例)，卡他莫拉菌阳性率为2.1% (2例)。将37例患者纳入定植组，痰液标本未发现细菌的患者纳入无定植组。其中，30%≤FEV1.0<50% COPD患者62例，该组患者中流感嗜血杆菌7例，肺炎链球菌8例，副流感嗜血杆菌6例，铜绿假单胞菌1例，卡他莫拉菌1例。FEV1.0<30% COPD患者34例，该组患者中流感嗜血杆菌5例，肺炎链球菌4例，副流感嗜血杆菌1例，铜绿假单胞菌2例，卡他莫拉菌1例。

2.2 COPD稳定期患者定植组与无定植组基线特征:37例纳入下呼吸道细菌定植组，59例纳入下呼吸道细菌无定植组，2组患者年龄、病程、吸烟指数一般资料无统计学差异(t分别为-0.54、-0.75、1.64，P均>0.05)，2组患者肺功能FEV1.0预计值(%)比较差异无统计学意义(t=-0.68，P>0.05)。

表1 COPD稳定期患者与无定植组患者基线特征比较

2.3 COPD稳定期患者定植组与无定植组观察指标的比较:定植组患者与无定植组患者25羟基维生素D水平分别为(16.67±3.40)ng/mL、(21.96±3.85)ng/mL，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)；经诱导痰后，定植组患者与无定植组患者痰上清液中IL-8水平分别为(318.27±49.98)pg/mL、(157.47±40.06)pg/mL，痰上清液中TNF-α水平分别为(8.96±1.67)pg/mL、(4.65±1.46)pg/mL，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 COPD稳定期患者定植组与无定植组观察指标比较

2.4 COPD稳定期患者25-(OH)D浓度与IL-8、TNF-α的相关性:25-(OH)D浓度与IL-8的Pearson 相关系数为-0.81，P<0.05,提示25-(OH)D浓度与IL-8呈明显负相关；25-(OH)D浓度与TNF-α的Pearson 相关系数为-0.72，P<0.05，提示25-(OH)D浓度与TNF-α呈明显负相关。

3 讨论

维生素D缺乏在COPD患者中普遍存在，导致COPD患者维生素D缺乏的原因有：①饮食不当，摄入不足，活动力下降，户外活动减少，导致日光照射不足；②糖皮质激素使用使维生素D分解代谢增强等[9]；③与维生素D结合基因的多态性相关，携带RS7041纯合子T等位基因的人患COPD的风险较大，并且更易表现出维生素D缺乏[10]。国外研究报道COPD患者维生素D缺乏与肺功能下降、生活质量评分下降有关[11]。维生素D在慢性阻塞性肺疾病中发挥的效应，不仅仅是对血钙和骨骼肌的作用，还有抗菌及免疫调节作用。维生素D不足可导致慢性呼吸道感染和气道细菌定植，增加细菌负荷及COPD的急性发作次数，具体机制为：维生素D是抗微生物肽如抗菌肽和防御素β基因表达的直接调控因子，能通过内源性免疫细胞促进抗菌肽和CD14的表达，可促进感染恢复[12]；呼吸道上皮细胞是呼吸道病原体的主要靶细胞，在上皮细胞中维生素D调节VDR介导的基因表达，通过涉及TLR受体CD14和抗菌肽的机制来识别和杀死病原体[13]。

本实验结果显示96例COPD稳定期患者存在下呼吸道细菌定植者有37例，定植菌常见的有流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、副流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌，与国内外报道一致[14-15]，且国内有研究报道COPD下呼吸道标本中副流感嗜血杆菌的分离率有上升趋势[16]。30%≤FEV1.0<50%的COPD稳定期患者与FEV1.0<30%的COPD稳定期患者相比较，下呼吸道细菌定植谱无明显差异。定植组患者血清25羟基维生素D水平明显低于无定植组，提示25羟基维生素D水平低下COPD患者易发生下呼吸道细菌定植，可能与维生素D调节固有免疫与获得性免疫有关，提示维生素D缺乏可能为COPD稳定期患者发生下呼吸道细菌定植的危险因素。慢性阻塞性肺疾病稳定期和急性加重期患者的IL-8水平明显高于健康对照组，提示IL-8参与COPD的气道炎症[17]。

国外研究显示IL-8、TNF-α水平可以反映COPD患者炎症反应和肺功能严重程度，从而反映疾病严重程度[18]，存在下呼吸道细菌定植的COPD患者的痰炎性因子明显高于无下呼吸道细菌定植的患者。本实验提示定植组患者痰上清液中IL-8、TNF-α水平明显高于无定植组，与上述研究结果基本符合。

国内有研究[19]发现COPD患者血清25-(OH)D水平与肺功能相关，与血清炎性因子INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10之间无线性相关。本实验检测痰炎性因子，发现25-(OH)D浓度与痰上清液中IL-8、TNF-α水平呈明显负相关，提示25-(OH)2D3浓度影响COPD气道炎症因子水平，可能机制为维生素D通过与呼吸道上皮细胞、单核/巨噬细胞等细胞维生素D受体结合，局部产生1，25-(OH)2D3，下调核因子κB(NF-κB)通路，抑制IL-8、IL-12、TNF-α等炎症介质及基质金属蛋白酶的释放，从而减轻炎症反应和肺组织破坏[20]。推测纠正维生素D缺乏可减少COPD患者下呼吸道细菌定植，发挥减轻气道炎症及减少COPD患者急性发作的作用。

综上所述， COPD稳定期患者缺乏维生素D更容易并发下呼吸道细菌定植，且维生素D水平与痰炎性因子IL-8、TNF-α水平呈负相关。

[1] Sethi S，Murphy TF.Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000:a state of the art review[J].Clinical Microbiology Reviews，2001，14(2):336-363.

[2] Finney LJ，Ritchie A，Pollard E，et al.Lower airway colonization and inflammatory response in COPD:a focus on Haemophilus influenzae[J].International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，2014，9(9):1119-1132.

[3] Tufvesson E，Bjermer L，Ekberg M.Patients with chronic obstructive pulmonary disease and chronically colonized with Haemophilus influenzae during stable disease phase have increased airway inflammation[J].International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，2015，4(10):881-889.

[4] Zittermann A，Pilz S，Hoffmann H，et al.Vitamin D and airway infections:a European perspective[J].European Journal of Medical Research，2016，21(21):14.

[5] Leow L，Simpson T，Cursons R，et al.Vitamin D，innate immunity and outcomes in community acquired pneumonia[J].Respirology (Carlton，Vic.)，2011，16(4):611-616.

[6] 中华医学会呼吸病学会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)[J].中华结核和呼吸杂志，2013，36(4)：255-264.

[7] 孙雪冬，陆地.气管切开患者下呼吸道定植菌的病原学研究[J].中华医院感染学杂志，2010，20(19)：2919-2920.

[8] 辛晓峰，修清玉，施毅，等.支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者吸入高渗盐水诱导痰的安全性和有效性观察[J].医学研究生学报，2006，19(7)：616-619.

[9] Holick MF，Chen TC.Vitamin D deficiency:a worldwide problem with health Consequences[J].The American Journal of Clinical Nutrition，2008，87(4):1080-1086.

[10] Janssens W，Bouillon R，Claes B，et al.Vtamin D deficiency is highly prevalent in COPD and correlates with variants in the vitamin D-Binding gene[J].Thorax，2010，65(3):215-220.

[11] Black PN，Scragg R.Relationship between serum 25-hydroxyvitamin D and pulmonary fuction in the third national health and nutrition examination survey[J].Chest,2005,128:3792-3798.

[12] Adams JS，Hewison M.Unexpected actions of vitamin D:new perspectives on the regulation of innate and adaptive immunity[J].Nature Clinical Practice.Endocrinology & Metabolism，2008，4(2):80-90.

[13] Hansdottir S，Monick MM，Hinde SL，et al.Respiratory epithelial cells convert inactive vitamin D to its active form:potential effects on host defense[J].Journal of Immunology (Baltimore，Md.:1950)，2008，181(10):7090-7099.

[14] Andelid K，Tengvall S，Andersson A.Systemic cytokine signaling via IL-17 in smokers with obstructive pulmonary disease:a Link tobacterial colonization [J].International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，2015，27(10):689-702.

[15] 吴翠仪，齐亚飞.慢性阻塞性肺疾病稳定期患者生活质量与下呼吸道细菌定植及炎症反应的相关性[J].中国老年医学杂志，2016，36(11)：5375-5377.

[16] 张桂玉，刘小平.副流感嗜血杆菌在慢性阻塞性肺疾病老年患者痰液中的分离率及耐药性[J].中国老年医学杂志，2013，33(5)：2128-2130.

[17] 肖艳君，金保红.慢性阻塞性肺疾病中IL-4,IL-8表达的临床意义[J].宁夏医学杂志，2013，35(2)：164-165.

[18] Zhang M.Li Q,zhang XY.relevance of lower airway bacterial colonization,airway inflammation,and pulmonary function in the stable stage of chronic obstructive pulmonary disease[J].European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases，2010，29(12):1487-1493.

[19] 蒋欢欢，戴玉荣.维生素D与COPD患者肺功能及血清炎症因子的相关性[J].温州医科大学学报，2016，46(2)：102-111.

[20] Sundar IK，Hwang JW，WU Shaoping，et al.Deletion of vitamin D receptor leads to premature emphysema/COPD by increased matrix metalloproteinases and lymphoid aggregates formation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，406(1):127-133.

AssociationofvitaminDdeficiencywithlowerairwaybacterialcolonizationandsputuminflammatoryfactorsinCOPDpatients

WANGShenlin,YANGZhao,ZHANGLiping.

DepartmentofRespiration,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China

YANGZhao,Email:greentree66611@sina.com

ObjectiveTo discuss the correlation between vitamin D deficiency on patients with COPD in stable phase with bacterial colonization in lower respiratory tract and sputum inflammatory factors.Methods96 cases with COPD in stable phase were selected. The venous blood was collected and level of 25-hydroxyl vitamin D in serum was determined with electrochemical method. Induced sputum was collected,and bacterial quantitative culture was preceded. 96 selected cases were divided into colonization group and non-colonization group according to existence of bacterial colonization in lower respiratory tract. Level of IL-8 and TNF-α in sputum supernatant were detected with ELISA method. Differences and correlation between 25-hydroxyl vitamin D in serum and IL-8,TNF-α in sputum supernatant in two groups of patients were analyzed.ResultsThere were 37 patients with bacterial colonization accounted for 38.54%. Level of 25-hydroxyl vitamin D of serum in colonization group was lower than that in non-colonization group. Levels of IL-8,TNF-α of sputum supernatant in colonization group were significantly higher than those in non-colonization group (P<0.05). 25-hydroxyl vitamin D in serum was negatively correlated with IL-8 and TNF-α in sputum supernatant respectively,Pearson correlation coefficients were -0.81 and -0.72 (P<0.05).ConclusionVitamin D deficiency in patients with COPD at stable phase prone to bacterial colonization in lower respiratory tract. 25-hydroxyl vitamin D in serum is negatively correlated with IL - 8 and TNF-α in sputum supernatant respectively.

Chronicobstructivepulmonarydisease;25-hydroxylvitaminD;Bacterialcolonization;Interleukine-8;Tumornecrosisfactor-α

R563

A

10.13621/j.1001-5949.2017.11.0964

国家自然科学基金资助项目(81560014)

宁夏人民医院呼吸内科，宁夏 银川 750002

王慎临(1984-)，女，硕士学位，主治医师，从事呼吸内科工作。

杨朝，Email:greentree66611@sina.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171109.1542.014.html

2017-06-16责任编辑马兴忠