环境新兴污染物双酚A暴露加重非酒精性脂肪性肝病大鼠脂质代谢异常*

丁雯瑾，孙 超，桑玉尔，陈梅梅，范建高，袁 涛

环境新兴污染物双酚A暴露加重非酒精性脂肪性肝病大鼠脂质代谢异常*

丁雯瑾，孙 超，桑玉尔，陈梅梅，范建高，袁 涛

目的探讨在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）背景下新兴环境污染物双酚A（BPA）对机体脂质代谢的影响。方法将18只SD大鼠随机分为正常饮食组、高脂饮食（NAFLD）组和NAFLD/BPA处理组，饲养12 w。采用Western blot法检测血清和肝组织脂代谢相关蛋白的变化。结果NAFLD组和NAFLD/BPA组肝质量分别为（20.5±2.8）g和（20.9±1.9）g、体质量为（500.1±19.1）g和（511.1±20.5）g、血清甘油三酯分别为（2.5±0.5）mmol/L 和（2.8±0.9）mmol/L、胆固醇为（2.4±0.7）mmol/L 和（2.8±0.6）mmol/L，游离脂肪酸（FFA）分别为（578.6±48.7）mmol/L 和（602.2±50.3）mmol/L，均显著高于正常组【（15.2±2.3）g、（432.5±13.2）g、（2.0±0.8）mmol/L、（1.0±0.6）mmol/L 和（487.4±14.9）mmol/L，P＜0.05】；与正常组比，NAFLD 组和NAFLD/BPA 组肝组织脂肪酸合成酶（FAS）分别上调了2.45倍和1.91倍，靶基因乙酰辅酶A合成酶（ACS）蛋白表达量分别下降了1.54倍和1.5倍（P＜0.05）。结论BPA的长期摄入可加重机体肥胖，促进血脂异常。

非酒精性脂肪性肝病；双酚A；脂质代谢；大鼠

双酚A（bisphenol A，BPA）、邻苯二甲酸酯和烷基酚是一类新兴环境污染物，亦称环境内分泌干扰物，世界卫生组织将其定义为：能使内分泌功能发生变化，从而对个体及子孙或者群体产生有害影响的外因性化学物质或混合物[1-3]。BPA是世界上使用最广泛的工业化合物之一，不仅产生量大，而且人群暴露途径多样，因此对健康的影响较大，而对其研究相对薄弱。有研究证实BPA可以模拟雌激素效应，引起人体内分泌系统功能紊乱，与代谢性疾病、生殖系统疾病和性激素依赖性肿瘤的发生密切相关[4-7]。成年人暴露于BPA后患肥胖、2型糖尿病及心脏病的几率增加[8]。国内流行病学调查也发现中老年人尿BPA浓度与全身型肥胖、腹型肥胖和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）呈正相关[9]。非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病机制尚不明确，通常认为与肥胖、IR、脂质紊乱、2型糖尿病和心血管疾病有关。本研究通过建立NAFLD动物模型，研究长期低剂量BPA暴露大鼠肝组织类固醇调节因子结合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）表达的变化，以探讨在脂肪肝背景下环境新兴污染物BPA与脂质代谢的关联，为NAFLD的防治研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器和试剂 4周龄SPF级雄性SD大鼠购自中国科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司【生产许可证号：SCXK（沪）2007-0005】，饲养于清洁级动物房。大鼠饲养实验室温度为23±2℃，湿度为50±10%。实行12/12h循环光线控制。自由摄取食物和水。检测血甘油三酯（TC）、总胆固醇（TG）和游离脂肪酸（FFA）试剂盒（美国Cell biolabs公司），抗脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）单克隆抗体（美国Santa公司，批号sc-55580），抗靶基因乙酰辅酶A合成酶（anti-acetyl CoA synthetase，ACS）兔多克隆抗体（美国 Abcam公司，批号 ab66038）、抗 SREBP裂解活化蛋白SCP、抗位点1蛋白水解酶（S1P）和抗位点2蛋白水解酶（S2P）兔多克隆抗体（美国Abcam公司，批号分别为 ab140592、ab175191和 ab189797），BPA（国药集团化学试剂上海有限公司，将其溶解于DMSO中，终浓度不超过1%）。

1.2 动物模型的建立 动物实验经上海交通大学实验动物伦理委员会批准并按其实验动物规范进行。适应性饲养大鼠1 w，随机分为正常饮食（ND）组、高脂饮食（HFD，88%普通饲料/10%猪油/2%胆固醇）组和高脂饮食/BPA（HFD/BPA）组，每组6只。让大鼠经饮水摄入BPA，为保证饮水中BPA含量（100 nmol/l），每2 d换水一次。在第12 w末，处死大鼠后称量体质量。取出肝脏，称量质量，计算肝指数（＝肝湿质量/体质量×100%）。

1.3 指标测定 常规检测血TC、TG和FFA水平；采用Western blot法检测肝组织 FAS、ACS、SCP、S1P 和 S2P 蛋白表达：取肝组织，提取总蛋白，蛋白上样量为50 μg，内参为GAPDH；加样后进行SDS-PAGE凝胶电泳，待蛋白分离后，将目的蛋白转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入 PBST 稀释的抗 FAS（1：1000）、抗 ACS（1：1000）、抗SCP1（1：1000）、抗 S1P（1：1000）和抗 GAPDH（1：5000）4℃孵育过夜。次日，用PBST洗膜5 min×3次，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1：3000），室温孵育 1 h。PBST 洗膜10 min×3次，置膜于暗处，待出现亮条带，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜PVDF膜包好，暗室中用X胶片感光、显影、定影。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以（±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量和肝质量的比较 NAFLD组和NAFLD/BPA组大鼠体质量和肝质量明显重于正常组（P＜0.05），而NAFLD/BPA 组与NAFLD 组比，无显著差异（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠体质量、肝质量与肝指数（±s）的比较

表1 大鼠体质量、肝质量与肝指数（±s）的比较

与正常组比，①P＜0.05，②P＜0.01

只 肝质量（g） 体质量（g） 肝指数正常组 6 15.2±2.3 432.5±13.2 3.5±0.5 NAFLD 6 20.5±2.8① 500.1±19.1① 4.1±0.3①NAFLD/BPA 6 20.9±1.9① 511.1±20.5② 4.1±0.8①

2.2 大鼠血脂和游离脂肪酸水平比较 见表2。

表2 大鼠血清生化指标（±s）的比较

表2 大鼠血清生化指标（±s）的比较

与正常组比，①P＜0.05，②P＜0.01；与 NAFLD 组比，③P＜0.05

只 TC（mmol/L） TG（mmol/L） FFA（mmol/L）正常组 6 2.0±0.8 1.0±0.6 487.4±14.9 NAFLD 6 2.5±0.5① 2.4±0.7② 578.6±48.7②NAFLD/BPA 6 2.8±0.9①③ 2.8±0.6② 602.2±50.3②③

2.3 大鼠肝组织SREBP相关蛋白表达的变化 与正常组比，NAFLD和NAFLD/BPA组动物肝组织FAS蛋白表达分别增加了2.45倍和1.91倍，而靶基因乙酰辅酶A合成酶（ACS）蛋白量则下调1.54倍和1.5倍（P＜0.05）。与此同时，SREBP裂解活化蛋白SCP、S1P和S2P无显著变化（图1）。

图1 各组肝组织SREBP相关蛋白表达的变化

3 讨论

近年来，美国食品药物管理局（FDA）禁止在奶瓶中使用BPA，使其对人类健康的危害进一步被重视。美国环境保护局甚至设立BPA日摄入量的最高浓度[10]。BPA是苯酚和丙酮衍生物，多用于罐头食品和饮料的包装、瓶类和牙齿填充物所用的密封胶。人群主要通过使用含BPA的包装物及饮料瓶而广泛暴露于BPA。本实验发现即便是在低浓度下，长期BPA摄入对大鼠的体质量和肝质量仍有影响。

内质网上的膜连接蛋白-SREBP能调节细胞脂质代谢，影响体内脂质含量的稳定。本实验结果表明，BPA暴露可进一步加重NAFLD大鼠TC和FFA调节异常。

本研究尚未发现高脂饮食的两组动物间与脂代谢相关的蛋白表达存在显著性差异，产生这种结果的原因可能有以下几种：①BPA的暴露剂量较低。FDA规定的BPA安全剂量是 50 μg·kg-1·d-1，本实验采用的剂量为 100 nmol/l，显著低于规定的极限剂量。但即便是低剂量的暴露，SD大鼠已发生血脂代谢异常；②暴露的时间问题。许多动物实验证实长期低剂量的BPA摄入仍可发生许多副作用，若进一步延长实验终点时间，或许各组蛋白表达量改变会进一步显著。

[1]Sheikh IA，Tayubi IA，Ahmad E，et al.Computational insights into the molecular interactions of environmental xenoestrogens 4-tert-octylphenol，4-nonylphenol，bisphenol A （BPA），and BPA metabolite，4-methyl-2，4-bis （4-hydroxyphenyl） pent-1-ene（MBP） with human sex hormone-binding globulin.Ecotoxicol Environ Saf，2017，135:284-291.

[2]Swan SH.Environmental phthalate exposure in relation to reproductive outcomes and other health endpoints in humans.Environ Res，2008，108（2）:177-184.

[3]Bonefeld-Jorgensen EC，Long M，HofmeisterMV，etal.Endocrine-disrupting potential of bisphenol A，bisphenol A dimethacrylate，4-n-nonylphenol，and 4-n-octylphenolin vitro:new data and a brief review.Environment Health Perspect，2007，115（Suppl 1）:69-76.

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[7]Fenichel P，Chevalier N，Brucker-Davis F.Bisphenol A:an endocrine and metabolic disruptor.Ann Endocrinol （Paris），2013，74:211-220.

[8]Lang IA，Galloway TS，Scarlett A，et al.Association of urinary bisphenol A concentration with medical disorders and laboratory abnormalities in adults.JAMA，2008，300（11）:1303-1310.

[9]Wang T，Li M，Chen B，et al.Urinary bisphenol A（BPA）concentration associates with obesity and insulin resistance.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（2）:e223-227.

[10]Vogel SA.The politics of plastics：the making and unmaking of bisphenol a“safety”.Am J Public Health，2009，99（Suppl 3）:S559-566.

（收稿：2017-02-10）

（本文编辑：陈宗炳）

Changes of lipid metabolism induced by bisphenol A in rats with NAFLD

Ding Wenjin，Sun Chao，Sang Yu’er，et al.Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital，Shanghai JiaoTong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Nonalcoholic fatty liver disease；Bisphenol A；Lipid metabolism；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.044

国家自然科学基金资助项目（编号：81400610）；教育部留学回国人员科研启动基金项目（编号：201404802）；上海市卫生和计划生育委员会青年科研项目（编号：20134Y043）；上海交通大学医工交叉研究基金资助项目（编号：YG2016MS72）

200092上海市 上海交通大学医学院附属新华医院消化科（丁雯瑾，孙超，桑玉尔，陈梅梅，范建高）；环境科学与工程学院（袁涛）

丁雯瑾，女，36岁，博士研究生，主治医师。主要从事肝病诊断与治疗学研究。Email:wenjin_ding@163.com

袁涛，Email：taoyuan@sjtu.edu.cn