利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗的改善作用*

邢 英，李雅丽，郑嵘炅，玛依拉·卡哈尔，木胡牙提·乌拉斯汉

利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗的改善作用*

邢 英，李雅丽，郑嵘炅，玛依拉·卡哈尔，木胡牙提·乌拉斯汉

目的研究利拉鲁肽对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠胰岛素抵抗（IR）的改善作用。方法取SD大鼠50只，采用高脂饲料喂养法建立NAFLD大鼠模型，将造模成功的32只大鼠随机分为4组，即模型组(A组，n=8），其余 3 组为不同剂量利拉鲁肽处理组，包括 B 组【0.9 mg·kg-1·d-1，n=8】、C 组【（1.8 mg·kg-1·d-1），n=8】和 D 组【（3.6 mg·kg-1·d-1，n=8】。在药物干预4 w后，取血和肝脏，制备肝组织匀浆，分别测定大鼠体质量、肝质量、肝指数、血糖、胰岛素（FINS）、血脂（TG、TC）、转氨酶（ALT、AST）、血清丙二醛（MDA）、谷胱甘肽氧化酶（GSH-Px）、肝组织超氧化歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。结果与模型组比，药物干预后大鼠体质量、肝指数、血ALT、FINS、FPG、HOMA-IR、MDA 和肝组织 TG、TC、MDA 水平均显著下降（P＜0.05），大剂量组上述指标下降显著高于中小剂量组（P＜0.05）；与模型组比，药物干预后大鼠肝组织GSH-Px和SOD水平均显著升高（P＜0.05），且大剂量组升高明显高于中小剂量组（P＜0.05）；各组间TNF-α变化无明显差异（P＞0.05）。结论利拉鲁肽能显著降低NAFLD大鼠血脂和血糖水平，改善IR，治疗作用呈明显的剂量相关性。

非酒精性脂肪性肝病；利拉鲁肽；胰岛素抵抗；谷胱甘肽氧化酶；超氧化歧化酶；大鼠

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD）发病率呈逐年上升趋势。对NAFLD发病机制及防治策略的研究已成为目前的热点[1]。改善胰岛素抵抗（IR）及肝脏炎症应激反应对防治NAFLD进展有重要意义[2]。由于胰高血糖素样肽 -1（glucagon like peptide-1，GLP-1）及其相关药物能够有效改善IR，促进体质量降低，同时对脂代谢进行调节，因此其在NAFLD的治疗研究中得到了日益广泛的应用[3]。现阶段，对GLP-1类似物，利拉鲁肽，治疗NAFLD效果的机制研究还较少[4]。本研究应用不同浓度的利拉鲁肽对NAFLD大鼠进行了干预，观察了其对动物血生化指标和肝组织病理学变化的影响，以探讨其可能的作用机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物与试剂 5周龄雄性健康清洁级SD大鼠，体质量为（150±10）g，购自新疆医科大学动物实验中心。高脂饲料（88%标准饲料+10%猪油+2%胆固醇）购自新疆医科大学动物实验中心。长效人GLP-1和利拉鲁肽购自丹麦诺和诺德公司。检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、人谷胱甘肽 - 过氧化物酶（human glutathione peroxidase，GSH-PX）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 非酒精性脂肪肝大鼠模型的制备 给予普通饲料喂养5 w后，将大鼠随机分为普通饲料喂养组（n=13）和模型组（n=33），分别给予普通饲料喂养或88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇构成的高脂饲料喂养。7 w后，随机处死对照组1只和模型组1只动物，行肝组织切片检查肝细胞脂肪变性情况，以确认制备模型成功。将剩余的成模大鼠32只随机分为对照组（A组，n=8），继续给予高脂饲料喂养或给予小剂量组（B 组，0.9 mg·kg-1·d-1，n=8）、中剂量（C 组，1.8 mg·kg-1·d-1，n=8） 和大剂量 （D 组，3.6 mg·kg-1·d-1，n=8）利拉鲁肽腹腔注射，并继续给予高脂饲料喂养。4 w后，禁食10 h，称量体质量，给予2%戊巴比妥钠45 mg·kg-1腹腔注射，开腹后穿刺腹主动脉取血，分离血清，-20℃冰箱保存。迅速摘取肝脏并称质量，计算肝指数，取肝右叶组织，制备冰冻切片，用苏丹III行脂肪染色，或制备石蜡切片，分别行HE染色和Masson三合染色，在光镜下观察。依据2006年2月中华医学会修订的NAFLD诊疗指南行病理学评分。另取肝组织，匀浆后，采用放射免疫法检测肝组织匀浆上清液SOD、MDA、GSH-Px和TNF-α。

1.3 血生化指标检测 使用全自动生化分析仪血清生化指标（贝克曼库尔特）；采用放射免疫法检测空腹胰岛素（FINS，上海拜力生物科技有限公司），并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。

1.4 统计学分析 应用 SPSS 18.0行统计软件，对服从正态分布的计量资料以±s表示，采用方差分析，采用LSD法行多重分析；对方差不齐的计量资料以【中位数（四分位数间距）】表示，采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般资料比较 与模型组比，药物干预后大鼠体质量、肝质量和肝指数显著下降（P＜0.05，表 1）。

表1 四组大鼠体质量、肝质量和肝指数（±s）比较

表1 四组大鼠体质量、肝质量和肝指数（±s）比较

与A组比，①P＜0.05

例数 体质量（g） 肝质量（g） 肝指数A 组 8 474.7±20.2 19.6±2.1 4.1±0.3 B组 8 420.7±20.2① 13.6±2.9① 3.2±0.5①C组 8 415.2±20.4① 11.5±2.5① 2.9±0.2①D组 8 397.3±19.6① 10.3±1.5① 2.6±0.3①

表2 四组大鼠血生化指标（±s）比较

表2 四组大鼠血生化指标（±s）比较

与A组比，①P＜0.05

例数AST（U/L） ALT（U/L） TG（mmol/L） TC（mmol/L）A组B组C组D组8 8 8 8 86.2±16.8 196.2±25.1 0.65±0.16 1.92±0.10 66.7±15.7① 86.2±16.8① 0.52±0.13① 1.35±0.15①52.1±15.2① 66.7±15.7① 0.41±0.10① 1.28±0.12①49.7±10.5① 49.7±10.5① 0.34±0.05① 1.21±0.10①

2.2 四组大鼠血清生化指标变化的比较 药物处理组大鼠血清ALT、TG、TC水平均显著下降，且大剂量组上述指标下降显著大于中小剂量组（P＜0.05，表 2）。

2.3 四组大鼠血 FPG、FINS和 HOMA-IR、GSH-Px水平比较 药物处理组大鼠血FINS、FPG和HOMA-IR均显著下降，且大剂量组上述指标下降显著高于中小剂量组（P＜0.05）；与模型组比，药物干预组大鼠GSH-Px显著升高，且大剂量组升高明显高于中小剂量组（P＜0.05，表 3）。

表3 四组大鼠血FPG、FINS和HOMA-IR、GSH-Px水平（±s）比较

表3 四组大鼠血FPG、FINS和HOMA-IR、GSH-Px水平（±s）比较

与A组比，①P＜0.05

例数AST（U/L） ALT（U/L） TG（mmol/L） TC（mmol/L）A组B组C组D组8 8 8 8 86.2±16.8 196.2±25.1 0.65±0.16 1.92±0.10 66.7±15.7① 86.2±16.8① 0.52±0.13① 1.35±0.15①52.1±15.2① 66.7±15.7① 0.41±0.10① 1.28±0.12①49.7±10.5① 49.7±10.5① 0.34±0.05① 1.21±0.10①

表4 四组大鼠肝匀浆TNF-α、MDA、SOD水平（±s）比较

表4 四组大鼠肝匀浆TNF-α、MDA、SOD水平（±s）比较

与A组比，①P＜0.05

例数AST（U/L） ALT（U/L） TG（mmol/L） TC（mmol/L）A组B组C组D组8 8 8 8 86.2±16.8 196.2±25.1 0.65±0.16 1.92±0.10 66.7±15.7① 86.2±16.8① 0.52±0.13① 1.35±0.15①52.1±15.2① 66.7±15.7① 0.41±0.10① 1.28±0.12①49.7±10.5① 49.7±10.5① 0.34±0.05① 1.21±0.10①

2.4 四组大鼠肝组织匀浆TNF-α、MDA和SOD水平比较 药物干预组大鼠肝组织匀浆MDA显著下降，且大剂量组下降显著大于中小剂量组（P＜0.05）；与模型组比，药物干预后大鼠肝组织SOD显著升高，且大剂量组升高幅度明显高于中小剂量组（P＜0.05）；各组肝组织匀浆TNF-α变化无明显差异（P＞0.05，表 4）。

3 讨论

NAFLD是一种在临床及组织病理学上与酒精性肝病相仿，但患者无饮酒史或很少饮酒的肝脏疾病[5]。NAFLD包括一系列病变，从单纯性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎，后者可进一步发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌[6]。全球NAFLD患病率高达20%，而且还在逐年增长。近年来，我国NAFLD发病率也呈逐年上升趋势[7]。因此，对NAFLD发病机制及防治策略的研究已成为目前研究的热点。NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现[8]，其发病机制包括胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、炎症因子、氧化应激、内质网应激及凋亡等[9]，其中胰岛素抵抗被认为是NAFLD病理生理基础的中心环节[10]。脂联素（adiponectin）是一种由244个氨基酸组成的蛋白质[11]，是一种几乎全部由脂肪细胞分泌的脂肪因子，也是唯一一个分泌量与脂肪细胞体积呈反比的脂肪因子，具有改善外周和肝脏胰岛素抵抗的作用。同时，脂联素通过与AdipoR1和AdipoR2结合后，分别激活AMPK和PPARα途径，减少脂肪酸合成，从而减少脂肪的储存，具有抗脂肪肝的作用[12]。有学者认为[13]，低脂联素血症应该是NAFLD的特征性标志，脂联素作为机体的一种保护性细胞因子，在治疗和防止NAFLD进展中扮演着重要的角色。脂联素有AdipoR1和AdipoR2两种受体，前者主要表达于骨骼肌上，后者则主要表达于肝脏[14]。脂联素须与受体结合后才能发挥作用，因此受体的改变将直接影响脂联素的作用[15]。当发生胰岛素抵抗时，过多的胰岛素可导致AdipoR2的减少，导致其介导的脂联素作用的下降。随着NAFLD的发展，肝组织AdipoR2的表达和脂联素一样逐渐下降。现认为AdipoR2为提高胰岛素敏感性的重要靶位[16]。NAFLD患者血清脂联素水平及肝脏AdipoR2表达较正常人低[17]。因此，提高脂联素及其受体水平可能成为治疗NAFLD的一个方向。

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其相关药物，因具有改善胰岛素抵抗、降低体质量、改善脂代谢等作用，也已经越来越多地被应用于NAFLD的治疗研究中[18]。GLP-1是主要由小肠L细胞分泌的一种生理性肽类激素，其作用是以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并抑制胰高血糖素分泌，被认为是增强胰岛素分泌作用最强的促胰岛素分泌肽。GLP-1已成为2型糖尿病治疗的一个重要靶点。GLP-1释放入血后与其特异性受体结合，不仅能促进胰岛素合成及分泌、刺激胰岛β细胞增殖及新生，并可以抑制胰高血糖素分泌、延缓胃排空、减少摄食。GLP-1可促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收，抑制肥胖个体脂肪组织巨噬细胞浸润和炎症反应，从而改善胰岛素抵抗。近来一些研究[19]发现GLP-1类似物可能通过上调血清脂联素水平，改善糖脂代谢，进而使机体胰岛素敏感性增加，但其具体机制及环节尚待进一步研究。从总体上来说，NAFLD的发病机制和治疗都是近年的研究热点，脂联素及其受体在NAFLD及其相关的代谢综合征、胰岛素抵抗中都有重要作用。作为目前研究最多的治疗NAFLD的药物胰高血糖素样肽-1是否对脂联素及其受体有影响，以及可能的机制还未见报道。本研究结果表明，与模型组比较，药物干预后大鼠体质量、肝指数、血 FINS、ALT、FPG、HOMAIR、肝组织MDA均显著下降，且大剂量组上述指标下降显著高于中小剂量组。与模型组比较，药物干预后大鼠肝组织GSH-Px、SOD均显著升高，且大剂量组升高明显高于中小剂量组。各组肝组织TNF-α变化无明显差异。

总之，利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠具有一定的治疗作用，促进胰岛素抵抗的减轻并降低MDA水平。

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（收稿：2016-12-14）

（本文编辑：陈从新）

Effects of liraglutide on insulin resistance in rats with nonalcoholic fatty liver disease

Xing Ying，Li Yali，Zheng Rongjiong，et al.Department of Infectious Diseases，First Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China

ObjectiveTo study the effect of different doses of liraglutide on insulin resistance（IR） in model rats with nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）.MethodsHigh fat diet was given to 50 male Sprague-Dawley rats to establish NAFLD and 32 rats with successful NAFLD were randomly divided into 4 groups，e.g.group A（model group，n=8），and liraglutide were given in group B[0.9 mg·kg-1·d-1，n=8]，group C[1.8 mg·kg-1·d-1，n=8]and group D[3.6 mg·kg-1·d-1，n=8].Rats were sacrificed after 4 weeks of medicine intervention.Data of body weight and liver weight were recorded.Blood from the abdominal aorta and livers were collected.Liver index，blood glucose，insuli（FINS），blood lipids（TG，TC），transaminase（ALT，AST），malondialdehyde （MDA），and glutathione peroxidase（GSH-Px），superoxide dismutase （SOD） and tumor necrosis factor alpha （TNF-alpha） in liver tissues were detected.ResultsCompared with in the model group，the rat body weight，liver index，ALT，FINS，FPG，HOMA-IR，MDA in blood and TG，TC，MDA in liver tissues decreased significantly in intervention groups（P＜0.05），and in group D with highest dose of liraglutide gained the most decrease in the above index than in the other two intervention groups（P＜0.05）；Compared with in model group，the GSH-Px and SOD in intervention groups significantly increased（P＜0.05），and GSH-Px and SOD in group D increased the most（P＜0.05）；There was no significant difference of TNF-α among all the groups.ConclusionLiraglutide can significantly reduce the liver index，serum lipid and blood glucose in rats with NAFLD，and improve IR，and the treatment effect is dose-dependent.

Nonalcoholic fatty liver disease；Liraglutide；Insulin resistance；Glutathione peroxidase；Superoxide dismutase；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.008

新疆维吾尔自治区科研基金-医学联合基金项目（编号：2015211CO53）；新疆医科大学第一附属医院自然科学基金项目（编号：2014ZRQN24）

830054 乌鲁木齐市 新疆医科大学第一附属医院内科VIP病区

邢英，女，34岁，硕士研究生，主治医师。主要从事糖尿病基础与临床研究。E-mail-xylylix@163.com

木胡牙提·乌拉斯汉，E-mail-liyayaeli@163.com