胆管细胞癌组织JAG1基因及其蛋白表达水平与患者预后的关系

牛福勇，李福荣

·肝癌·

胆管细胞癌组织JAG1基因及其蛋白表达水平与患者预后的关系

牛福勇，李福荣

目的探讨JAG1蛋白表达水平对胆管细胞癌患者肿瘤切除术后预后的判断价值。方法2010年1月～2014年12月我院诊治的胆管细胞癌患者60例和良性胆道疾病患者60例。检测胆管细胞癌组织、癌旁组织和肝组织JAG1 mRNA及其蛋白表达，测定胆管癌患者术后血清JAG1水平。应用单因素和多因素非条件Logistic回归分析胆管癌患者手术后预后的危险因素。结果癌旁组织、肝组织、胆管癌组织JAG1蛋白阳性率分别为45.0%（27/60）、56.7%（34/60）和 81.7%（49/60），组间差异有统计学意义（P＜0.05）；三种组织 JAG1 mRNA 水平和蛋白相对表达量分别为（0.91±0.34）和（0.57±0.15）、（1.15±0.48）和（0.84±0.47）、（1.96±0.58）和（1.64±0.58），组间差异有统计学意义（P＜0.05）；胆管癌患者血清JAG1水平为（205.35±22.51）pg/ml，显著高于良性胆道疾病患者【（102.56±16.52）pg/ml，P＜0.05】；肝内胆管癌患者血清 JAG1 水平与 CA125（r=0.41，P＜0.05）、CEA（r=0.0.27，P＜0.05）、CRP（r=0.17，P＜0.05）、肿瘤浸润深度（r=0.13，P＜0.05）、淋巴结转移（r=0.08，P＜0.05）、TNM 分期（r=0.14，P＜0.05）、肿瘤分化程度（r=0.15，P＜0.05）呈正相关；多因素Cox比例风险回归模型分析显示，肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、分化程度、血清JAG1高水平是影响胆管癌患者无复发生存时间的危险因素（P＜0.05），肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、血清JAG1高水平是影响胆管癌患者总生存时间的危险因素（P＜0.05）。结论JAG1蛋白可以作为胆管细胞癌患者肿瘤切除术后的预后指标，血清JAG1水平高患者术后预后差。

胆管细胞癌；JAG1蛋白；预后

胆管细胞癌（Cholangiocellular carcinoma，CCC）是一种肝内胆管细胞恶性增生性肿瘤[1-3]。本研究检测了CCC组织JAG1蛋白表达的变化，以探讨其对CCC患者肿瘤切除术后预后的判断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2010年1月～2014年12月在我院接受肿瘤手术切除、术后病理学检查证实的CCC患者60例，男36例，女24例；年龄35～78岁，平均年龄（60.12±15.58）岁。纳入标准：根据国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）标准对胆管癌组织进行肿瘤TNM分期，根据Lauren′s分型标准进行组织病理学分型，根据Jewett-Marshall分期方法进行肿瘤生长浸润深度分期，参照前人报道的方法评价淋巴结转移[4]。另选同期在本院就诊的60例胆道良性疾病患者作为对照，男32例，女28例；年龄 37～80岁，平均年龄（60.77±14.91）岁。对照组中胆总管结石26例，胆总管狭窄16例，胆管炎8例，慢性胆囊炎10例。患者或直系亲属签署知情同意书，本研究获得我院医学伦理学委员会批准。

1.2 肿瘤组织JAG1 mRNA及其蛋白表达检测 CCC患者行手术切除，取切除肿瘤组织、癌旁组织、少量肝组织冷冻保存。自-80℃低温冰箱取出待检CCC组织、癌旁组织或肝组织25～40 mg，按照RNA提取试剂盒（北京宜科思源科技有限公司）说明书要求，提取总RNA，并以此为底物进行Real-time PCR。其中，JAG1 F:5′-CTCATCAGCCGTGTCTCA AC-3'，R:5'-GGCACACACACTTAAATCCG-3'；GAPD HF:5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R:5'-GGG GTCGTTGATGGCAACA-3'。扩增条件为:95℃ 3min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环。以实验组（△Ct）- 对照组（△Ct）=△△Ct，即2-△△Ct为mRNA水平。提取各组组织蛋白，采用Western blot法（杭州联科生物技术股份有限公司）检测蛋白浓度。以目的蛋白与内参照蛋白GAPDH的积分吸光度比值表示蛋白相对表达量。按照文献报道的方法判断JAG1蛋白阳性结果[5-8]。

1.3 血清JAG1水平及生化指标检测 使用美国R&D systems公司生产的ELISA试剂盒测定血清JAG1水平。使用深圳雷杜公司 RT7200全自动血液分析仪和日本奥林巴斯公司AU2700型全自动生化分析仪检测血生化指标和肿瘤标志物。

1.4 随访 使用上海耀壮检测仪器设备有限公司9206C X线检查仪、徐州市大为电子设备有限公司DW-500全数字超声诊断仪、飞利浦MRI03设备于术后每隔3个月复查X线、超声、MRI检查。根据CT和MRI结果诊断是否复发，必要时行穿刺或手术确诊。临床医师结合本院门诊复查病例资料及电话进行随访，随访至患者死亡或2015年12月31日。其中，手术至复发的时间间隔为无复发生存时间（Relapse free survival，RFS），手术至死亡或末次随访日期为总生存时间（Overall survival，OS）。

1.5 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料采用x2检验。采用Spearman秩相关行相关性分析。P＜0.05为差异有显著性统计学意义，P＜0.01为差异有非常显著性统计学意义。采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，确定影响RFS和OS的不良预后因素。多分类变量以哑变量的形式进入回归模型，变量入选标准α≤0.05，剔除标准α＞0.05。

2 结果

2.1 不同组织JAG1基因及其蛋白表达情况 癌旁组织、肝组织、胆管癌组织JAG1蛋白阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）；不同组织 JAG1 mRNA及其蛋白表达水平见表1、图1、图2。

表1 不同组织 JAG1 mRNA及其蛋白表达水平比较

图2 不同组织JAG1蛋白表达情况

2.2 胆管癌患者血清JAG1水平及其与实验室指标的相关性 60例胆管癌患者血清JAG1水平为（205.35±22.51）pg/ml，显著高于 60例对照组的（102.56±16.52）pg/ml（P＜0.05）；在胆管癌患者，血清JAG1水平与血清CA125、CEA、CRP呈正相关（P＜0.05），与其它指标无显著性相关（P＞0.05，表 2）。

2.3 胆管癌患者血清JAG1水平与临床病理学参数的相关性 胆管癌患者血清JAG1水平与性别、年龄无相关性（P＞0.05），与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤分化程度呈正相关（P＜0.05，表3）。

表2 60例胆管癌患者血清指标及其与JAG1水平的相关性

表3 60例胆管癌患者临床病理学参数与血清JAG1水平的相关性

2.4 影响CCC患者预后的多因素Logistic回归分析 经随访，60例CCC患者的RFS和OS分别为（42.60±15.65）个月和（45.90±17.43）个月，影响CCC患者预后的多因素Logistic回归分析结果显示，肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、细胞分化程度、血清JAG1高水平是影响胆管癌患者RFS的危险因素（P＜0.05），而肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、血清JAG1高水平是影响胆管癌患者OS的危险因素（P＜0.05，表4）。

3 讨论

JAG1基因在染色体上定位于20p12，是5种Notch配体中的一种，属于DSL蛋白家族，为单次跨膜蛋白，在细胞增殖分化过程中主要通过激活Notch 信号通路发挥作用[9，10]。

目前，国内外关于JAG1蛋白表达水平对CCC患者肿瘤切除术后预后影响的研究相对较少。欧阳合意等通过检测肝细胞癌组织JAG1表达情况发现，JAG1表达与患者年龄、肿瘤分化程度、血清HBsAg阳性与否与预后有关，认为JAG1的异常表达与肝癌的发生、发展和分化密切相关[11-13]。在小鼠和人类，JAG1蛋白作为Notch信号通路的配体与胆管癌的发生发展密切相关[14]。胆管癌患者血清JAG1水平显著高于对照组，多因素Logistic回归分析结果显示，血清JAG1高水平是影响胆管癌患者RFS和OS的危险因素。

表4 影响胆管癌患者预后的多因素Logistic回归分析

胃腺癌组织JAG1蛋白表达下调可能与胃腺癌的发生、浸润和转移等多个环节有关[15-17]。在乳腺癌组织，Notchl和JAG1表达增强与恶性肿瘤侵袭性增强、预后不良存在密切联系[18]。因为JAG1作为Notch受体的配体，通过与受体结合，导致Notch胞内段裂解，并进入细胞核，进而激活Notch信号通路，调解下游靶基因的转录。JAG1致癌机制主要与患者自身表达失调、异常激活Notch信号通路或其他信号通路有关。大量研究证实，在肿瘤组织中可检测到JAG1异常表达。JAG1在CCC发病中的作用机制主要有通过激活Notch信号通路和Ras介导的信号通路发挥抗凋亡、诱导细胞增殖效应，促进胆管癌细胞生长等。它还可能抑制Smad家族信号分子活性，减轻肿瘤生长抑制效应。JAG1与HBx可能结合，HBx通过调节JAG1的表达加大JAG1的作用力度[19，20]。

[1]Spolverato G，Kim Y，Alexandrescu S，et al.Management and outcomes of patients with recurrent intrahepatic cholangiocarcinoma following previous curative-intent surgical resection.Ann Surg Oncol，2016，23（1）:1-9.

[2]Kang SI，Kang J，Park HS，et al.Metastatic cholangiocarcinoma as a cause of appendicitis:a case report and literature review.J Hepatobiliary Pancreat Surg，2014，18（2）:60-63.

[3]Lee SW，Lee IS，Yu KC，et al.A case of mixed adenoneuroendocrine carcinoma of the common bile duct:Initially diagnosed as cholangiocarcinoma.Kor J Pathol，2014，48（6）:445-448.

[4]Lange S，Lampe J，Bossow S，et al.A novel armed oncolytic measles vaccine virus for the treatment of cholangiocarcinoma.Hum Gene Ther，2013，24（5）:554-564.

[5]Patel T.New insights into the molecular pathogenesis of intrahepatic cholangiocarcinoma.J GastroenterolHepatol，2014，49（2）:165-172.

[6]Frampton G，Coufal M，Li H，et al.Opposing actions of endocannabinoids on cholangiocarcinoma growth is via the differential activation ofNotch signaling.Exp CellRes，2010，316（9）:1465-1478.

[7]Leong KG，Niessen K，Kulic I，et al.Jagged 1-mediated Notch activation induces epithelial-to-mesenchymal transition through slug-induced repression of E-cadherin.J Exp Med，2011，204（12）:2935-2948.

[8]Masakazu S，Eiji O，Yu N，et al.High expression of the Notch ligand Jagged-1 is associated with poor prognosis after surgery for colorectal cancer.Cancer Sci，2016，107（11）:1705-1716.

[9]Katoh M.Notch ligand，JAG1 is evolutionarily conserved target of canonical WNT signaling pathway in progenitor cells.Int J Mol Med，2006，17（4）:681-685.

[10]刘兆国，朱智杰，周梁，等.Notch信号通路与肿瘤研究.中国药理学通报，2012，28（8）:1045-1048.

[11]欧阳合意，张艳丽，陈小伍，等.肝癌组织DLK1和Jagged1表达临床意义探讨.中华肿瘤防治杂志，2015，22（8）:610-613.

[12]康凯夫，张艳丽，欧阳合意.肝癌组织ABCG2和Jagged1表达临床意义的探讨.中华肿瘤防治杂志，2013，20（6）:453-457.

[13]刘虹，李建.Notch1受体和配体分子Jagged1蛋白在肝癌组织中的表达及意义.中国现代医学杂志，2012，22（10）:45-48.

[14]Che L，Fan B，Pilo MG，et al.Jagged 1 is a major Notch ligand along cholangiocarcinoma development in mice and humans.Oncogenesis，2016，73（5）:256-265.

[15]曹玉文，杜小明，李文琴，等.Jagged-1基因在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达及临床意义.中国妇幼保健，2014，29（34）:5661-5663.

[16]张秀青，李万胜，沈素朋，等.卵巢上皮性癌中Notch-1和Jagged-1的表达及临床意义.现代肿瘤医学，2015，21（7）:977-980.

[17]王连东，孔亮，邓玉，等.胃腺癌组织Notch1和Jagged1蛋白表达临床意义分析.中华肿瘤防治杂志，2013，20（21）:1661-1664.[18]Dickson BC，Mulligan AM，Zhang H，et al.High-level JAG1 mRNA and protein predict poor outcome in breast cancer.Modern Pathol，2007，20（6）:685-693.

[19]Che L，Fan B，Pilo MG，et al.Jagged 1 is a major Notch ligand along cholangiocarcinoma developmentin mice and humans.Oncogenesis，2016，73（5）:274-281.

[20]Hofmann JJ，Zovein AC，Koh H，et al.Jagged 1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development:insights into Alagille syndrome.Development，2010，137（23）:4061-4072.

（收稿：2017-01-20）

（本文编辑：陈从新）

JAG1 protein expression on prognosis of patients with cholangiocellularcarcinome aftersurgical resection

Niu Fuyong，LiFurong.DepartmentofHepatobiliary Surgery，FirstHospital，Yulin 719000，Shaanxi Province，China

ObjectiveTo investigate the JAG1 protein expression on the prognosisofpatientswith intrahepatic cholangiocellular carcinoma（CCC）.Methods60 patients with intrahepatic cholangiocarcinoma in our hospital between Jan 2010 and Dec 2014 were included and 60 patients with benign biliary diseases who were treated in our hospital during the same period were selected as control.JAG1 mRNA and its protein in liver tissues were detected.Serum JAG1 level was also measured by ELISA.Laboratory and clinical pathological parameters were recorded and the correlations of them to JAG1 were calculated.Univariate and multivariate unconditional Logistic regression analysis of risk factors for postoperative prognosis in patients with CCC was conducted.ResultsIn paracancerous tissues，liver tissues and cholangiocarcinoma tissues，the positive expression rates of JAG1 protein were 45.0%（27/60），56.7%（34/60）and 81.7%（49/60），respectively，and the relative levels of JAG1 mRNA were （0.91±0.34）and （0.57±0.15），（1.15±0.48） and （0.84±0.47），（1.96±0.58） and （1.64±0.58），respectively，（P<0.05）;serum JAG1 level in patients with CCC was（205.35±22.51）pg/ml，significantly higher than that in the controls[（102.56 ±16.52）pg/ml，P ＜0.05]；serum JAG1 level in patients with intrahepatic CCC was positively correlated with CA125 （r=0.41，P<0.05），CEA （r=0.0.27，P<0.05），CRP （r=0.17，P<0.05），tumor invasion depth（r=0.13，P<0.05），lymph node metastasis（r=0.08，P<0.05），TNM stage（r=0.14，P<0.05）and tumor differentiation（r=0.15，P<0.05）；multivariate Cox proportional hazard regression model analysis showed that the depth of tumor invasion，lymph node metastasis，TNM staging，differentiation，high serum JAG1 level were the risk factors of relapse free survival（RFS）in patients with bile ductcarcinoma （P<0.05）；the depth oftumor invasion，lymph node metastasis，TNM staging，high serum JAG1 levels were the risk factors of overall survival（OS）in patients with bile duct carcinoma（P<0.05）.ConclusionJAG1 protein can be used as a specific marker for the prognosis of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma after surgical resection and patients with high serum JAG1 levels may have a poor prognosis.

Cholangiocellular carcinome；JAG1 protein；Prognosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.024

719000陕西省榆林子洲县 榆林市第一医院肝胆外科

牛福勇，男，34岁，大学本科，主治医师。主要从事腹腔镜肝胆疾病治疗研究 。E-mail:niufuyong1983@163.com