污泥中嗜酸酵母菌的分离鉴定及其重金属耐受性研究*

邱秀文 周桂香，3 王天峰 单瑶瑶 杨期勇#

(1.九江学院鄱阳湖生态经济研究中心，江西 九江 332005；2.九江市流域管理与生态保护重点实验室(九江学院)，江西 九江 332005；3.土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所)，江苏 南京 210008；4.九江学院化学与环境工程学院，江西 九江 332005)

污泥中嗜酸酵母菌的分离鉴定及其重金属耐受性研究*

邱秀文1，2周桂香1，2，3王天峰4单瑶瑶4杨期勇1，2#

(1.九江学院鄱阳湖生态经济研究中心，江西 九江 332005；2.九江市流域管理与生态保护重点实验室(九江学院)，江西 九江 332005；3.土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所)，江苏 南京 210008；4.九江学院化学与环境工程学院，江西 九江 332005)

从污水处理厂的活性污泥中分离纯化出一株嗜酸异养菌，命名为JJU-2，并对其进行了形态观察、生理生化特性测试及26S rDNA的D1/D2区序列分析，鉴定该菌株为假丝酵母菌(Candidapalmioleophila)。进一步对JJU-2菌株的生长特性和重金属耐受性进行研究。结果表明：该菌株最适生长pH为3～6，且能适应pH<3的极端酸性环境，最适生长温度为25 ℃，最高耐受温度为40 ℃，当培养至3 h，JJU-2菌株进入对数生长期，培养至18 h进入稳定期。Cr3+、Ni2+、Pb2+对JJU-2菌株的最低抑菌摩尔浓度分别为20、2.0、40 mmol/L。

嗜酸性 序列分析 重金属耐受性 假丝酵母菌

随着我国经济发展和城市化进程的加快，生活污水的排放量和处理比例也快速增加[1]。污泥是污水生物处理过程中产生的副产物，随着污水处理力度的不断加大，污泥产量也在快速增加[2]。污泥中含有丰富的有机质、氮、磷、钾等，所以污泥农用成为污泥资源化利用的有效途径之一[3]。污泥农用可提高土壤有机质含量，改善土壤物理性状并提供植物需要的养分，但是城市污泥中高含量的重金属是限制污泥农用的重要因素之一[4]。目前，脱除污泥中重金属的方法有吸附法、化学法和生物淋滤法等[5]。其中，生物淋滤法因耗酸量小、成本低、重金属去除率高、实用性强等优点而越来越受关注[6]。

生物淋滤法是指利用自然界中一些微生物的直接作用或其代谢产物的间接作用，产生氧化、还原、络合、吸附或溶解作用，将固相中某些不溶性成分(如重金属、硫等)浸出的一种技术[7]。目前，用于生物淋滤的微生物主要是化能自养微生物，该类微生物生长缓慢，重金属去除效果差[8-9]。有研究表明，自养微生物的一些代谢产物对其自身的生长有抑制作用[10-11]。若在生物淋滤过程中加入以有机物为能源物质的嗜酸异养菌，就可在一定程度上解除这种抑制作用，有利于自养微生物的生长，充分发挥其去除污泥中重金属的作用，提高去除率[12-13]。因此，筛选嗜酸异养菌对于提高自养微生物生物淋滤去除重金属效率具有重要意义。从污水处理厂的活性污泥中分离得到一株嗜酸异养菌，命名为JJU-2，对该菌株进行形态学观察和分子鉴定，同时对该菌株的生理生化特征、生长特性和重金属耐受性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 培养基

基础盐溶液：(NH4)2SO42.5 g/L、KCl 0.1 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、Ca(NO3)20.2 g/L，用稀硫酸调pH至4，在121 ℃灭菌15 min。

BSYG液体培养基：1 L基础盐溶液中配入1 g/L葡萄糖、1 g/L酵母膏。

BSYG固体培养基：BSYG液体培养基加1%(质量分数)琼脂。

1.2 菌株的富集与分离

JJU-2菌株的富集培养采用BSYG液体培养基。JJU-2菌株的纯化采用平板涂布分离法，pH用稀硫酸调至4。将涂布的平板置于30 ℃的培养箱中倒置培养2～3 d，即可长出单菌落。然后，选择具有代表性的单菌落在显微镜下观察，重复数次，直至获得目的菌株的纯培养。

1.3 菌种鉴定

1.3.1 形态及生理生化鉴定

将富集纯化的JJU-2菌株经平板涂布置于25 ℃培养箱培养48 h，观察单菌落形态，并于显微镜下观察菌体形态。参照文献[14]对JJU-2菌株做进一步鉴定。

1.3.2 菌株基因组DNA的提取

离心收集5 mL JJU-2菌体，用pH=8的TE缓冲液洗涤3次，弃上清液，沉淀备用。采用Ezup柱式基因组DNA提取试剂盒(SK8257)提取JJU-2菌株的基因组DNA。

1.3.3 26S rDNA的D1/D2区的聚合酶链式反应(PCR)扩增

26S rDNA的D1/D2区的PCR扩增采用引物为：正向引物NL1(5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAAAAG-3’)和反向引物NL4(5’-GGT CCG TGTTTC AAG ACG G-3’)。PCR反应体系(50 μL)：模板1 μL，10×Buffer 5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 2 μL，高保真(Taq) DNA聚合酶0.4 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，加去离子水至50 μL。扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，32个循环后72 ℃ 10 min。取5 μL产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果。

1.3.4 PCR扩增产物的纯化与测序

PCR扩增产物采用凝胶回收试剂盒(SK8131)纯化。纯化产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序工作。

1.3.5 序列分析和系统发育树的构建

根据供试菌株的26S rDNA的D1/D2区序列，运用BLAST程序在GenBank数据库中分别进行同源序列搜索。下载相关菌种的序列，用MEGA 4软件进行系统发育树的构建。

1.4 菌株生理生化特征分析

1.4.1 碳源发酵测定

利用14种有机物进行发酵测试，25 ℃培养3 d。

1.4.2 最适初始pH的测定

各取99 mL BSYG液体培养基装于6个250 mL三角瓶中，将pH分别调节为1～6，121 ℃下灭菌15 min。然后，接种处于对数生长期的1 mL菌液至培养基中，置于25 ℃、180 r/min下振荡培养。培养至3 h后，每隔2 h测定600 nm处的吸光度(OD600)。试验重复3次。

1.4.3 最适生长温度的测定

各取99 mL BSYG液体培养基装于6个250 mL三角瓶中，将pH调节为5，121 ℃下灭菌15 min，接种处于对数生长期的1 mL菌液至培养基中，分别置于不同温度(20～45 ℃)下，180 r/min振荡培养。培养至3 h后，每隔2 h测定OD600。试验重复3次。

1.5 菌株对重金属的耐受能力测定

将培养至对数期的JJU-2菌株涂布于设置了不同浓度重金属(Cr3+、Ni2+、Pb2+，分别以硫酸铬、硫酸镍、硝酸铅配制)的BSYG固体培养基中，置于25 ℃的培养箱中倒置培养2～3 d，观察JJU-2菌株的生长情况。

2 结果与讨论

2.1 菌株的形态和碳源发酵测定

如图1所示，JJU-2菌株在BSYG固体培养基上形成白色菌落，菌落表面呈圆形凸起，表面湿润光滑且有光泽，不透明，质地黏稠，边缘齐整；JJU-2菌株细胞呈圆形或卵圆形，出芽增殖。

如表1所示，该菌株可利用大部分有机物进行繁殖，但不利用尿素、L-半胱氨酸、甘油、乙酸、草酸铵。根据文献[15]，初步判断JJU-2菌株为酵母菌。

图1 JJU-2菌株的形态学特征Fig.1 The morphological characteristics of the strain JJU-2

2.2 26S rDNA的D1/D2区序列的系统发育树分析

表1 JJU-2菌株的碳源发酵测定1)

注：1)“+”表示可利用；“-”表示不可利用。

依据形态及生理特征难以对酵母菌进行准确鉴定，而分子鉴定技术是一种更有效且准确的鉴定手段。目前，一般认为酵母菌同一个种的不同菌株其26S rDNA的Dl/D2区碱基差异不超过1%，因此大多数种都可通过该序列分析进行区别。KURTZMAN等[16]通过26S rDNA的D1/D2区序列分析对500余种酵母菌进行了鉴定，确定了大部分菌种的系统发育地位。谢婕等[17]利用26S rDNA的D1/D2区序列分析，对采自西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中的酵母菌进行分子生物学鉴定，结果表明，该方法可有效鉴定不同的酵母菌种。褚学英等[18]借助分子技术对7株酵母菌进行鉴定，通过同源性比较和系统发育树分析发现，其中6株菌与GenBank数据库中已知酵母有较高的相似性和亲缘关系，另外1株菌确定为新种。本实验对JJU-2菌株进行了26S rDNA的D1/D2区分子鉴定，结果见图2。JJU-2菌株的26S rDNA的D1/D2区序列与假丝酵母菌(Candidapalmioleophila)17323(KJ705005.1)序列处于同一分支，其相似度最高。因此，结合其形态、生理生化特征和分子鉴定技术，鉴定JJU-2菌株属假丝酵母菌。

2.3 JJU-2菌株的生长曲线

由图3可见，JJU-2菌株在1～3 h为延滞期。3～12 h为对数生长期，该时期由于营养充足，环境条件适宜，菌体生长速率大，胞内酶系活跃、代谢旺盛，JJU-2菌株数量呈指数增长。12～18 h，JJU-2菌株数量上升变缓，增殖率降低，开始向稳定期过渡。JJU-2菌株接种18 h数量达到最大值，此后数量无明显变化，说明JJU-2菌株进入稳定期，该时期JJU-2菌株数量没有净增长或净减小，保持在相对平衡状态。

图2 JJU-2菌株的系统发育树分析Fig.2 The phylogenetic tree of the strain JJU-2

图3 JJU-2菌株的生长曲线Fig.3 The growth curve of the strain JJU-2

2.4 pH对JJU-2菌株的生长活性影响

从图4可以看出，JJU-2菌株在不同的pH情况下生长存在差异，最适生长pH为3～6，当pH=2时生长仍良好，当pH=1时仍能生存。这表明，JJU-2菌株能适应极端的酸性环境。当pH从5增至6时，JJU-2菌株的OD600反而下降。当pH>6或pH<1时，菌株细胞酶活力受到抑制，不利于菌株的生长[19]。酵母菌在自然界中分布广泛，在陆地、城市污泥和水环境中均有发现[20-25]。酵母菌主要生长在偏酸性环境中，可利用各种底物进行生长。到目前为止，关于酵母菌在极端酸性环境(pH<3)的研究鲜见报道。JJU-2菌株的分离为嗜酸异养菌协助去除污泥中的重金属提供了良好的材料。

图4 pH对JJU-2菌株的生长活性影响Fig.4 The effect of pH on the growth activity of the strain JJU-2

2.5 温度对JJU-2菌株的生长活性影响

如图5所示，当温度≥35 ℃时，JJU-2菌株生长缓慢，最高耐受温度为40 ℃，45 ℃时JJU-2菌株基本停止生长。20～30 ℃时，JJU-2菌株均生长良好，25 ℃时OD600达到最大。所以，JJU-2菌株的最适生长温度为25 ℃，说明JJU-2菌株为中温型微生物。

图5 温度对JJU-2菌株的生长活性影响Fig.5 The effect of temperature on the growth activity of the strain JJU-2

樊洁[26]研究了不同温度对酵母菌株A05生长活性的影响，结果表明，菌株A05在20～25 ℃时生长缓慢，在30～35 ℃时生长良好。杭姣等[27]从新疆罗布泊地区取得一株浅白隐球酵母菌，研究发现，该菌在39 ℃的高温中也能正常生长，表明浅白隐球酵母菌是耐高温型菌。该菌与JJU-2菌株有很大差异。刘滢等[28]研究了温度对增香酵母菌株C6生长活性的影响，发现菌株C6的最适生长温度为28 ℃，在24～32 ℃内均良好生长。该菌株最适温度与JJU-2菌株最适温度基本接近。

2.6 JJU-2菌株对重金属离子的耐受性研究

不同金属离子抑制菌株生长的最低浓度叫做最低抑菌浓度(MIC，以摩尔浓度计)。通常MIC与菌体的重金属耐受性成正比。从图6可以看出，Cr3+、Ni2+、Pb2+对JJU-2菌株的MIC分别为20、2.0、40 mmol/L。因此，JJU-2菌株对3种重金属离子的耐受能力由强到弱依次为Pb2+(40 mmol/L)>Cr3+(20 mmol/L)>Ni2+(2.0 mmol/L)。

丽丽[29]研究了Pb2+对酵母菌株WT6-5生长的影响，结果表明，较低浓度Pb2+可刺激酵母菌株WT6-5的生长，高浓度Pb2+则会抑制菌株WT6-5的生长。这与本研究分离到的菌株对Pb2+的抗性一致。王世梅等[30]从固体废物中分离得到酵母菌株R30，研究发现，不同浓度Cr3+对酵母菌株R30的生长有影响，当Cr3+>10 mmol/L时明显抑制酵母菌株R30的生长。这与JJU-2菌株对Cr3+的耐受能力接近。

图6 JJU-2菌株对不同摩尔浓度重金属离子的耐受性Fig.6 The tolerance of JJU-2 strain to different heavy metals of different molar concentrations

3 结 论

(1) 从污水处理厂的活性污泥中分离得到JJU-2菌株。通过对JJU-2菌株进行形态学鉴定、生理生化特征测试及26S rDNA的D1/D2区序列分析，确定该菌株为假丝酵母菌。

(2) JJU-2菌株最适生长pH为3～6，当pH=2时生长良好，当pH=1时仍能生存，说明JJU-2菌株能适应极端的酸性环境；最适生长温度为25 ℃，最高耐受温度为40 ℃；JJU-2菌株培养至3 h进入对数生长期，培养至18 h进入稳定期。

(3) JJU-2菌株对Cr3+、Ni2+、Pb2+均有不同程度的耐受性，MIC分别为20、2.0、40 mmol/L。

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Isolationandidentificationofanacidophilusyeastfromsewagesludgeanditstolerancetoheavymetal

QIUXiuwen1，2，ZHOUGuixiang1，2，3，WANGTianfeng4，SHANYaoyao4，YANGQiyong1，2.

(1.PoyangLakeEco-economyResearchCenter，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005；2.JiujiangKeyLaboratoryofBasinManagementandEcologicalProtection，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005；3.StateKeyLaboratoryofSoilandSustainableAgriculture，InstituteofSoilScience，ChineseAcademyofSciences，NanjingJiangsu210008；4.CollegeofChemistryandEnvironmentalEngineering，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005)

A heterotrophic acidophilic strain，named JJU-2，was isolated from sewage sludge of a sewage treatment plant. JJU-2 was identified asCandidapalmioleophilaby morphology，chemical and physical characteristics and 26S rDNA D1/D2 gene sequence analysis. The experiment of grow characteristics and tolerance to heavy metal was carried out. The results showed that：the optimum pH was 3-6 and it tolerated extreme acid environment (pH<3). The optimum temperature and the highest temperature were 25 ℃ and 40 ℃，respectively. The strain JJU-2 grew to logarithmic phase after 3 hours of inoculation and grew to stable phase after 18 hours. The maximum tolerance concentrations of Cr3+，Ni2+and Pb2+were 20，2.0 and 40 mmol/L，respectively.

acidophily; sequence analysis; tolerance to heavy metal;Candidapalmioleophila

邱秀文，男，1984年生，博士，讲师，研究方向为环境微生物。#

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*国家自然科学基金资助项目(No.21367014)；江西省自然科学基金资助项目(No.20151BAB203026)；江西省科技厅对外科技合作计划项目(No.20132BDH80008)；江西省教育厅科技项目(No.GJJ14732)；长江水环境教育部重点实验室开放课题(No.YRWEF201502)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.11.001

2016-10-04)