川楝素对TRAIL抗肝癌活性及其机制研究

史 杰 王 芳

川楝素对TRAIL抗肝癌活性及其机制研究

史 杰1王 芳2

目的 观察川楝素对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）抗肝癌活性影响并研究其机制。方法 将HepG2人肝癌细胞分为对照组、川楝素组、TRAIL组、川楝素+TRAIL组及川楝素+TRAIL+DR5小干扰RNA（DR5 siRNA）组，CCK-8法检测HepG2细胞活力，流式细胞术检测HepG2细胞的凋亡和线粒体膜电位，Western blot实验和流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5表达水平及Caspase-8、Caspase-3活化水平。结果 TRAIL+川楝素组HepG2相对细胞活力（0.42±0.04），显著低于 TRAIL 单治疗组（0.84±0.07，P＜0.05）和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 组（0.76±0.06，P＜0.05）。TRAIL+川楝素组HepG2细胞凋亡率（32.7±2.4）%，显著高于TRAIL单治疗组[（9.3±0.9）%，P＜0.05]和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组[（13.8±1.1）%，P＜0.05]。川楝素处理对HepG2细胞Bcl-2家族蛋白的表达无明显影响，但能显著提高HepG2细胞表面DR5表达水平。TRAIL+川楝素组 HepG2细胞的相对线粒体膜电位（0.26±0.02），显著低于 TRAIL 单治疗组（0.78±0.06，P＜0.05）和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 组（0.68±0.05，P＜0.05）。TRAIL+川楝素组 HepG2细胞 Caspase-8表达水平（0.37±0.04），显著高于 TRAIL 单治疗组（0.11±0.04，P＜0.05）及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 组（0.14±0.02，P＜0.05）；TRAIL+川楝素组 HepG2 细胞 Caspase-3 表达水平（0.42±0.04），显著高于TRAIL 单治疗组（0.13±0.02，P＜0.05）及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 组（0.17±0.02，P＜0.05）。结论川楝素可上调肝癌细胞死亡受体5（DR5）表达，提高TRAIL抗肿瘤活性。

肝细胞肝癌；川楝素；DR5；TRAIL

肝癌是预后很差的恶性肿瘤，致死率非常高[1]。尽管手术治疗是目前治疗肝癌最为有效的手段，然而对于中晚期不能进行手术的患者，化疗或免疫治疗是不可替代的治疗手段[2]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）属于肿瘤坏死因子超家族成员。研究[3]表明，TRAIL能诱导肿瘤细胞发生凋亡而对正常细胞的功能无明显影响，因此TRAIL是一种非常有临床应用前景的肿瘤治疗药物。然而某些类型的肿瘤细胞，如肝细胞肝癌细胞对TRAIL治疗的敏感性较低[4]，因此辅以其它药物提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性是提高其疗效的有效方法。本研究的目的在于探讨川楝素对TRAIL抗肝癌活性的影响并研究其机制。

1 材料与方法

1.1 材 料 川楝素购于南京春秋生物工程有限公司。人重组TRAIL、细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）、和凋亡检测试剂盒购于美国Sigma-Aldrich。DMEM培养基购于美国Gibco。死亡受体5（DR5）、活化半胱天冬酶-8（cleaved caspase-8）、活化半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）和β肌动蛋白（β-actin）抗体购于美国Cell Signaling。DR5-PE流式细胞抗体购于美国Ramp;D system。增强化学发光（ECL）试剂盒购于美国Pierce。DR5小干扰RNA（DR5 siRNA）购于上海吉玛制药技术有限公司。脂质体 2000（Lipofectamine2000）购于美国 Invitrogen。

1.2 细胞培养 人肝细胞肝癌细胞系HepG2购于中科院上海细胞库。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。细胞每2～3天传代1次，传代时，用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态并用DMEM培养基洗涤2次，将细胞悬液按1:3稀释后传代。

1.3 DR5基因沉默 为了抑制HepG2细胞中DR5的表达，在HepG2细胞中用Lipofectamine2000对DR5 siRNA按试剂操作说明书步骤进行转染。简要步骤如下：将DR5 siRNA或对照siRNA（终浓度为50pmol/mL）用Lipofectamine2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。将贴壁的HepG2细胞置于该无血清培养基孵育6h，之后弃去无血清培养基加入新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24h。收集细胞用于后续实验。DR5 siRNA转染后的HepG2细胞由于存在DR5干扰RNA，因此其DR5的表达受到明显抑制。

1.4 相对细胞活力测定 将HepG2细胞按5×103/孔接种在96孔板中。实验分为对照组、川楝素组、TRAIL组、川楝素+TRAIL组及川楝素+TRAIL+DR5siRNA组。对照组、川楝素组、TRAIL组和川楝素+TRAIL组所用细胞为转染对照siRNA的HepG2细胞，川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组所用细胞为转染DR5 siRNA的HepG2细胞。对照组为细胞不加药物处理48h；川楝素组为细胞加入50μmol/mL川楝素处理48h；TRAIL组为细胞加入2ng/mL TRAIL培养48h；川楝素+TRAIL组为细胞用2ng/mL TRAIL联合50μmol/mL川楝素处理48h；川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组为DR5 siRNA转染的细胞用2ng/mL TRAIL联合50μmol/mL川楝素处理48h。药物处理完毕后加入20μL CCK-8试剂并在37°C恒温培养箱中培养2h，450nm波长下测定OD值。HepG2相对细胞活力用OD药物处理组/OD对照组表示。

1.5 Western blot实验 将 HepG2细胞按 1×106/孔接种在6孔板中，按上述进行分组。药物处理完毕后用蛋白提取液提取HepG2细胞中的总蛋白质。将等量的总蛋白质用12.5%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF 膜上，用 Bcl-2、Bcl-xl、Bax、DR5、活化 Caspase-8、活化Caspase-3和β-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。蛋白灰度值分析用Image J软件处理。目标蛋白的相对表达水平用它们的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

1.6 HepG2细胞表面DR5表达水平 将HepG2细胞按1×106/孔接种在6孔板中，分为对照组和川楝素组处理。收集细胞并将细胞用带PE荧光标记的DR5抗体进行孵育，孵育完毕后用流式细胞仪检测两组细胞表面DR5的表达情况。

1.7 线粒体膜电位测定 将HepG2细胞按1×106/孔接种在6孔板中，按1.4所述进行分组。处理完毕后按试剂操作说明书步骤将细胞用JC-1染料进行孵育，孵育完毕后用流式细胞仪检测JC-1发出的红色荧光，红色荧光强度越强，线粒体膜电位越高[5]。药物处理组的相对线粒体膜电位为各处理组的JC-1荧光强度与对照组荧光强度的比值。

1.8 细胞凋亡实验 将HepG2细胞按1×106/孔接种在6孔板中，按上述进行分组。药物处理完毕后按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，Annexin-V阳性细胞即为凋亡细胞。

2 结果

2.1 各组HepG2细胞活力和凋亡率比较 CCK-8细胞活力实验结果显示，TRAIL+川楝素组HepG2的相对细胞活力显著低于TRAIL单处理组和川楝素单处理组（见表1）。流式细胞实验结果显示，TRAIL+川楝素组HepG2细胞凋亡率显著高于TRAIL单处理组和川楝素单处理组，表明川楝素显著增强TRAIL对HepG2细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性，见表1。

表1 各组HepG2细胞活力和凋亡率比较（±s）

表1 各组HepG2细胞活力和凋亡率比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与 TRAIL 组比较，#P＜0.05，与川楝素组比较，amp;P＜0.05；与 TRAIL+川楝素组比较，□P＜0.05；TRAIL：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，DR5 siRNA：死亡受体5小干扰RNA

组别对照组TRAIL组川楝素组TRAIL+川楝素组TRAIL+川楝素+DR5 siRNA组孔数3 3 3 3 3相对细胞活力1.0±0.08 0.84±0.07*0.92±0.07 0.42±0.04#amp;0.76±0.06□细胞凋亡率（%）2.2±0.2 9.3±0.9*3.9±0.3 32.7±2.4#amp;13.8±1.1□

2.2 各组HepG2细胞表面DR5表达水平比较

Western blot实验结果显示，川楝素处理对HepG2细胞Bcl-2家族蛋白的表达无明显影响但能显著提高HepG2细胞DR5表达水平（见图1，表2）。为了确定川楝素能否上调HepG2细胞表面DR5受体的表达，使用PE荧光标记的DR5抗体进行流式细胞实验。结果显示川楝素处理能提高HepG2细胞表面DR5受体的数量（见图2）。另外，当转染DR5 siRNA后，TRAIL联合川楝素对HepG2细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性均显著下降（见表1），表明川楝素通过上调DR5表达提高HepG2细胞对TRAIL的敏感性。

图1 各组HepG2细胞DR5表达水平

图2 各组HepG2细胞表面DR5数量。DR5：死亡受体5

表2 各组HepG2细胞DR5表达水平比较（±s）

表2 各组HepG2细胞DR5表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与TRAIL+川楝素组比较，□P＜0.05；Bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；Bcl-xl：B 细胞淋巴瘤/白血病-2样蛋白 1（BCL2-like1）；Bax：B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白；DR5：死亡受体5蛋白；β-actin：肌动蛋白；TRAIL：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；DR5 siRNA：死亡受体5小干扰RNA。

组别对照组TRAIL组川楝素组TRAIL+川楝素组TRAIL+川楝素+DR5 siRNA组孔数3 3 3 3 3 Bcl-2相对表达水平0.76±0.06 0.79±0.07 0.72±0.05 0.77±0.06 0.73±0.05 Bcl-xl相对表达水平0.55±0.05 0.52±0.05 0.53±0.04 0.56±0.05 0.58±0.06 Bax相对表达水平0.37±0.04 0.40±0.05 0.34±0.04 0.38±0.05 0.35±0.04 DR5相对表达水平0.28±0.03 0.32±0.04 0.68±0.07*0.70±0.07*0.25±0.03□

2.3 川楝素促进HepG2细胞TRAIL诱导的线粒体途径凋亡 流式细胞结果显示，TRAIL+川楝素组HepG2细胞的相对线粒体膜电位显著低于TRAIL单处理组和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组（见表3）。Western blot结果显示，TRAIL+川楝素组 HepG2细胞Cleaved Caspase-8表达水平及Cleaved Caspase-3表达水平均显著高于TRAIL单处理组和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组（见图3，表3）。

表3 各组HepG2细胞线粒体膜电位、Caspase-8、Caspase-3活化水平比较（±s）

表3 各组HepG2细胞线粒体膜电位、Caspase-8、Caspase-3活化水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与 TRAIL 组比较，#P＜0.05；与川楝素组比较，amp;P＜0.05；与 TRAIL+川楝素组比较，□P＜0.05；Cleaved Caspase-8：活化半胱天冬酶-8；Cleaved Caspase-3：活化半胱天冬酶-3；β-actin：肌动蛋白；TRAIL：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；DR5 siRNA为死亡受体5小干扰RNA

组别对照组TRAIL组川楝素组TRAIL+川楝素组TRAIL+川楝素+DR5 siRNA组孔数3 3 3 3 3线粒体膜电位1.00±0.07 0.78±0.06*0.97±0.07 0.26±0.02#amp;0.68±0.05□caspase-8 0.01±0.01 0.11±0.04*0.02±0.01 0.37±0.04#amp;0.14±0.02□caspase-3 0.01±0.01 0.13±0.02*0.04±0.01 0.42±0.04#amp;0.17±0.02□

图3 各组HepG2细胞Caspase-8和Caspase-3活化

3 讨论

川楝子是一味传统中药，它具有明显的镇痛作用且还可用于治疗寄生虫病，对诸如蛔虫等有良好的杀灭作用。川楝素是川楝子中的主要活性成分，具有很强的药理学活性。近年研究发现，川楝素还具有一定的抗肿瘤作用。在肺癌的治疗中，川楝素能抑制肺癌细胞对药物诱导的凋亡的抵抗性[6]；在结直肠癌的治疗中，川楝素能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其发生凋亡[7]；在白血病的治疗中，川楝素能通过激活脱氧胞苷激酶促进白血病细胞的凋亡[8]。本研究发现，川楝素能显著增强TRAIL对肝癌细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性，表明川楝素与TRAIL存在协同效应，能提高TRAIL的抗肝癌活性。

在TRAIL信号通路中，TRAIL首先与死亡受体4（DR4）或死亡受体 5（DR5）结合形成死亡受体复合物，该复合物能募集细胞中的Caspase-8并使之发生活化。活化的Caspase-8能剪切Bid蛋白使之成为活化形式。活化的Bid能转位到线粒体外膜上，使肿瘤细胞的线粒体发生失能并打开线粒体外膜孔道，导致线粒体膜电位下降并使线粒体中的凋亡活性物质（如细胞色素C）通过线粒体外膜孔道释放到细胞质中，从而诱导细胞发生线粒体途径的凋亡[9-11]。Bcl-2家族蛋白成员是调控细胞凋亡的重要分子[12]。本研究结果发现川楝素处理并不能显著影响肝癌细胞Bcl-2 家族蛋白成员（Bcl-2、Bcl-xl、Bax）的表达；研究发现，川楝素能显著上调TRAIL的特异性受体DR5表达水平，同时增加肝癌细胞表面DR5的数量。当用小干扰RNA下调肝癌细胞表面DR5的表达后，川楝素对TRAIL的协同效应受到明显抑制，证明川楝素可能通过增加肝癌细胞表面的DR5受体数量增强TRAIL依赖的凋亡信号，促使肝癌细胞发生Caspase-8活化，导致细胞发生线粒体途径的凋亡。

总之，本研究显示川楝素能显著提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性，增强TRAIL的抗肿瘤活性。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［2］ Huang JS，Chang PH.Refractory hypoglycemia controlled by systemic chemotherapy with advanced hepatocellular carcinoma：A case report［J］.Oncol Lett，2016，11（1）：898-900.

［3］ Joshi P，Jeon YJ，Croce CM，et al.MicroRNA-148a reduces tumorigenesis and increases TRAIL-induced apoptosis in NSCLC［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（28）：8650-8655.

［4］Omar HA，Arafa el SA，Weng JR，et al.Sensitization of hepatocellular carcinoma cells to Apo2L/TRAIL by a novel Akt/NFkappaB signalling inhibitor［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2014，114（6）：464-471.

［5］ Prathapan A，Vineetha VP，Raghu KG.Protective effect of Boerhaavia diffusa L.against mitochondrial dysfunction in angiotensin II induced hypertrophy in H9c2 cardiomyoblast cells［J］.PLoS One，2014，9（4）：e96220.

［6］Li X，You M，Yin W，et al.Reversal of the Apoptotic Resistance of Non-Small-Cell Lung Carcinoma towards TRAILby Natural Product Toosendanin［J］.Sci Rep，2017，7：42748.

［7］ Wang G，Feng CC，Zhang J，et al.Toosendanin inhibits growth and induces apoptosis in colorectal cancer cells through suppression of AKT/GSK-3β/β -catenin pathway［J］.Int J Oncol，2015，47（5）：1767-1774.

［8］Ju J，Qi Z，Chen Y，et al.The apoptotic effects of toosendanin are partially mediated by activation of deoxycytidine kinase in HL-60 cells［J］.PLoS One，2012，7（12）：e52536.

［9］ Riddick E，Evans S，Banerjee HN，et al.Identification of death receptors DR4 and DR5 in HTB-12 astrocytoma cell lines and determination of TRAIL sensitivity［J］.J Solid Tumors，2013，3（6）：20-26.

［10］Huang G，Chen X，Xing C，et al.miR-20a-directed regulation of BID is associated with the TRAIL sensitivity in colorectal cancer［J］.Oncol Rep，2017，37（1）：571-578.

［11］Laussmann MA，Passante E，Rehm M，et al.Proteasome inhibition can impair caspase-8 activation upon submaximal stimulation of apoptotic tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand （TRAIL） signaling［J］.J Biol Chem，2012，287（18）：14402-14411.

［12］ Hatok J，Racay P.Bcl-2 family proteins：master regulators of cell survival［J］.Biomol Concepts，2016，7（4）：259-270.

Effect of Toosendanin on TRAIL Inhibiting Hepatocellular Carcinoma and the Related Mechanism

SHI Jie1,WANG Fang2.
1Clinical Laboratory,Cixi People's Hospital,Ningbo(315300),China；2Clinical Laboratory,Zhejiang Hospital,Hangzhou(310007),China

Objective To investigate the effect of toosendanin on enhancing the anti-tumor effect of TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL） on hepatocellular carcinoma and the underlying mechanism.Methods HepG2 cells were divided into control group,toosendanin group,TRAIL group,toosendanin+TRAIL group and toosendanin+TRAIL+DR5 small interfering RNA（DR5 siRNA）group.CCK-8 assays were performed to evaluate the viability of HepG2 cells.Flow cytometry analysis was performed to detect the cell apoptosis and mitochondrial membrane potential in HepG2.Western blot and flow cytometry analysis was performed to evaluate the expression of DR5 on HepG2 cell surface and the activation of caspase-8 and caspase-3.Results Relative cell viability of HepG2 in TRAIL+toosendanin group（0.42±0.04） was significantly lower than that in TRAIL group（0.84±0.07,P＜0.05） and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（0.76±0.06,P＜0.05）.Apoptotic rate of HepG2 cells in TRAIL+toosendanin group（32.7±2.4）%was significantly higher than that in TRAIL group[（9.3±0.9）%,P＜0.05]and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group[（13.8±1.1）%,P＜0.05].Treatment with toosendanin did not change the expression of Bcl-2 family proteins but significantly increased the expression of DR5 on the surface of HepG2.Relative mitochondrial membrane potential of HepG2 in TRAIL+toosendanin group（0.26±0.02） was significantly lower than that of TRAIL group（0.78±0.06,P＜0.05） and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（0.68±0.05,P＜0.05）.Relative expression of cleaved caspase-8（0.37±0.04） and cleaved caspase-3（0.42±0.04） in TRAIL+toosendanin group were both higher than the cleaved caspase-8（0.11±0.04） and cleaved caspase-3（0.13±0.02） in TRAIL group and the cleaved cas－pase-8（0.15±0.02） and cleaved caspase-3 （0.17±0.02） in TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（all P＜0.05）.Conclusion Toosendanin enhances the anti-tumor effect of TRAIL by upregulating the expression of DR5 in hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma;toosendanin;DR5;TRAIL

1浙江省慈溪市人民医院检验科（宁波 315300）；2浙江医院检验科（杭州 310007）

史杰，E-mail：cixishijie@163.com；Tel：15867236288

（收稿：2017-03-08 修回：2017-05-31）