PCR-RFLP法对蛇胆川贝散中川贝母的鉴别研究

朱林，蒲婧哲，张亚中,，程旺兴，金斌

·药物与临床·

PCR-RFLP法对蛇胆川贝散中川贝母的鉴别研究

朱林1，蒲婧哲2，张亚中1,2，程旺兴1，金斌2

目的：研究聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法(PCR-RFLP法)对蛇胆川贝散(胶囊)中川贝母鉴定的可行性。方法本实验选取8个厂家的蛇胆川贝散(胶囊)作为研究对象，对模板DNA的预处理方法进行考察，通过PCR-RFLP法对提取的DNA进行扩增和酶切。结果自提样本中只有川贝母自提样本的PCR产物可被酶切，8个厂家成药样本的PCR产物均不能被Sma I酶切。结论PCR-RFLP法对蛇胆川贝散(胶囊)中川贝母的鉴别具有很高的灵敏度和准确度，对市场上成药中川贝母的真伪鉴别提供了较好的依据。

蛇胆川贝散； 川贝母； PCR-RFLP法； 鉴别； 可行性

蛇胆川贝散(胶囊)处方均由蛇胆汁和川贝母二味药材组成，制法为川贝母粉碎成细粉，与蛇胆汁按6∶1的比例混匀，干燥，粉碎。具有祛风止咳，除痰散结的功效，适用于风热咳嗽，痰多气喘，胸闷，咳痰不爽或久咳不止等症[1]。由于川贝母市场价格较高，且贝母属的一些贝母与川贝母形态相似、价格较低，因此市售川贝母替代使用现象严重[2]，常见替代品有以下几种：浙贝母、湖北贝母、伊犁贝母、新疆贝母、平贝母等。目前，川贝母常用的鉴别方法以性状鉴别和色谱鉴别为主，但由于贝母属的一些贝母与川贝母化学成分较为相似，因此常用的鉴别方法都存在一定的局限性[3-13]。尤其当川贝母以原料药投入至成药中，鉴别难度加大。近年来，学者们对聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法(以下简称PCR-RFLP法)的研究突飞猛进，并广泛应用到医药学领域，提供了一种新的分析方法[14-18]。《中国药典》2010年版一部增补本中新增了川贝母PCR-RFLP法鉴别，该方法从DNA角度对贝母进行分析鉴别，具有灵敏度高和准确度高的特点[19]。但目前本方法仅限于药材鉴定，本研究将此方法应用到蛇胆川贝散(胶囊)的成药当中，以考察成药中川贝母的真伪情况。本次研究选取8个厂家的四十余批蛇胆川贝散(胶囊)作为实验样本，同时模拟生产工艺，自提样本。通过此方法的研究，首次将PCR-RFLP法应用到成药中，为完善成药中的川贝母真伪鉴定方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 PCR仪(ABI)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，分析天平(MettlerAB135-S)，纯水仪(Millipore公司)，全自动凝胶成像系统(Syngene Gene Genius)，球磨仪(M400，Retsch)。

1.2 试剂 新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)(天根生化科技(北京)有限公司)，川贝母-R、川贝母- F引物(华大基因)，TaKaRa EX Taq酶(RR01AM；TaKaRa)，Sma I限制性内切酶(1085A；TaKaRa)，核酸染料Genegreen(天根)，琼脂糖(西班牙Biowest公司)。

2 方法

2.1 样本

2.1.1 实验中所用成药来源 本实验所用的样本，来自于8个厂家生产的蛇胆川贝散(胶囊)成药。阳性对照选取川贝母中的暗紫贝母(批号121000-201007)。见表1。

表1 样本信息及来源

2.1.2 自提样本 本实验模拟蛇胆川贝散(胶囊)的生产工艺，分别取川贝母、平贝母、浙贝母、伊贝母、湖北贝母的对照药材与蛇胆汁按蛇胆川贝散(胶囊)组成比例(6∶1)混合，混匀后在80 ℃烘箱中烘30 min，作为自提样本。见表2。

表2 自提样本中贝母信息

2.2 模板DNA预处理方法考察 方法一：将自提样本及成药加50%乙醇超声10 min，离心，弃去上清液，沉淀分别加水30 mL，混匀，离心3次，弃去水液，将沉淀置80℃烘箱中烘30min，取出，研细，即得。方法二：取自提样本及成药粉末，研细，即得。经考察，方法一与方法二结果一致，不经预处理结果无干扰，故样本直接进行DNA提取。成药经不同预处理方法的PCR结果，见图1。

1:DNA分子标记(DNA molecular marker)(100bp、250bp、500bp); 2: 阴性; 3～4: 阳性对照;5: Z1(方法一); 6: Z2(方法一); 7: Z3(方法一); 8: Z4(方法一); 9: Z1(方法二); 10: Z2(方法二); 11: Z3(方法二); 12: Z4(方法二);

图1 成药预处理方法考察PCR扩增凝胶成像图

2.3 DNA提取 取粉末20 mg，按照新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)(天根生化科技(北京)有限公司)说明书进行操作，得供试品溶液，置零下20℃冰箱备用。另取川贝母阳性对照20 mg，精密称定，同法制成阳性对照模板DNA溶液。

3 PCR反应条件

本实验设计了2个不同的PCR反应体系进行条件优化：

体系一：总体积为30 μL，反应体系包括10×PCR缓冲液3 μL，dNTP(10 mmol/L)0.4 μL，二氯化镁(25 mmol/L)2 μL，鉴别引物(30 μmol/L)各0.5 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2 μL，灭菌超纯水21.4 μL；体系二：总体积为30 μL，反应体系包括10×PCR缓冲液3 μL，dNTP(10mmol/L)0.4 μL，二氯化镁(25 mmol/L)2 μL，鉴别引物(30 μmol/L)各0.3 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2 μL，灭菌超纯水21.8 μL。对2种体系进行比较，使用反应体系一的扩增结果较好，故本次实验选择体系一作为PCR反应体系。循环次数的考察：本实验对循环次数设计了4个不同的梯度进行比较，以优化扩增程序，次数为25次、30次、35次、40次。结果循环次数为30次的扩增效果最佳，故本次实验选择30次为循环次数。退火温度的考察：本实验对退火温度设计了5个不同的梯度进行比较，以优化扩增程序，温度为55 ℃,58 ℃,60 ℃,62 ℃,65 ℃。结果退火温度为62 ℃的条带最清晰，故本次实验选择62 ℃为退火温度。

3.1 鉴别引物 上游：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’；下游：5’-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’。

3.2 酶切反应体系 取PCR反应液，在200 μL离心管中进行，反应总体系为20 μL，反应体系包括10×酶切缓冲液2 μL，PCR反应液6 μL，Sma I(10 U/μL)0.5 μL，BSA 2 μL，灭菌超纯水9.5 μL。酶切反应参数：30℃，2 h。

3.3 琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像 使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压150 V，约30 min，电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。

4 结果

4.1 PCR-RFLP法实验结果 在自提样本中，只有川贝母的自提样本PCR产物能够被限制性内切酶Sma I切成2个片段，大小在100～250 bp，其它贝母自提样本，均不能被Sma I酶切。见图2自提样本PCR-RFLP凝胶成像结果图；8个厂家成药样本的PCR产物均不能被Sma I酶切，见图3成药PCR-RFLP凝胶成像结果图。

1-2:川贝母阳性对照;3:PBZT;4:ZBZT;5:HBZI;6:YBZT;7:青贝;8:松贝;9:太白贝母;10:瓦布贝母;11:阴性;12:DNA分子标记(100bp、250bp、500bp)

图2 自提样本PCR-RFLP结果图

1-2:川贝母阳性对照;3:Z1;4:Z2;5:Z3;6:Z4;7:Z5;8:Z6;9:Z7;10:Z8;11:阴性;12:DNA分子标记(100bp、250bp、500bp)

图3 成药PCR-RFLP结果图

4.2 方法检出限考察 本研究为考察成药中川贝母的检出限，选取国药集团冯了性(佛山)药业的蛇胆川贝散为样本，分别按照5%,25%,50%,75%,100%比例掺入川贝母阳性对照(批号121000-201007)，制备检出限实验样本。检出限样本信息，见表3。每份取20 mg，按照上述PCR-RFLP法进行检测，结果表明：当成药中含有川贝母的限度为5 %时，此方法即可适用，PCR-RFLP法检出限结果，见图4。

表3 检出限样本的信息

2-3:J1;4-5:J2;6-7:J3;8-9:J4;10-11:J5;12:DNA分子标记(100bp，250bp，500bp)

图4 方法检出限PCR-RFLP结果图

5 讨论

成药中鉴定川贝母的真伪问题一直是一个难点。由于蛇胆川贝散(胶囊)成分仅为川贝母与蛇胆汁，且蛇胆汁所占比例较小，故干扰较小，且川贝母为原粉入药。这也是我们能够把PCR-RFLP法应用到此成药的前提条件。

通过8个厂家的蛇胆川贝散(胶囊)和4批自提样品，研究PCR-RFLP法对成药中川贝母鉴别的可行性，结果发现8个厂家蛇胆川贝散(胶囊)的PCR产物均不能被Sma I酶切，只有川贝母自提样本有酶切条带。厂家生产的蛇胆川贝散(胶囊)中存在使用贝母属其它贝母替代川贝母投料使用的可能性。本实验对两种反应体系进行了考察，对循环次数和退火温度进行了梯度实验，根据实验结果最终确定本实验的反应体条件。

虽然PCR-RFLP法对于川贝母的药材的鉴别已经有不少研究[20-26]，但缺少对成药中川贝母掺伪的鉴别，这也增加了本研究的难度。经过实验的探索与研究，得出了PCR-RFLP法对成药中川贝母掺伪的鉴别有着很高的准确度和灵敏度，为PCR-RFLP法的完善和优化作出一定的理论依据，尤其对市售蛇胆川贝散(胶囊)及其他成药中川贝母掺伪的鉴别提供理论依据，对市售含川贝母药品的质量有着强有力的督促。

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安徽省科技攻关计划项目(1501041174)

1.安徽中医药大学 研究生院，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品药品检验研究院 中药室，安徽 合肥 230051

朱林(1993-)，男，在读研究生。

程旺兴(1971-)，男，教授，博士，E-mail:chengwangxing@gmail.com。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.06.038

R 282.5

A

1008-7044(2017)06-0719-04

2017-05-17)