不同贮藏年限敖汉苜蓿种子活力及生理特性的研究

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(1.中国农业大学草业科学系 草业科学北京市重点实验室， 北京 100193；2.赤峰市农牧科学研究院草原研究所， 内蒙古 赤峰 024031)

不同贮藏年限敖汉苜蓿种子活力及生理特性的研究

陈玲玲1,2，程航1，张阳阳1，张晔1，王思琪1，毛培胜1

(1.中国农业大学草业科学系 草业科学北京市重点实验室， 北京 100193；2.赤峰市农牧科学研究院草原研究所， 内蒙古 赤峰 024031)

种子在贮藏过程中随着贮藏时间的延长出现老化现象，使种子活力下降、生理特性发生变化，从而降低种用价值。为探讨不同贮藏年限紫花苜蓿种子的活力变化，选择室温贮藏0～3年的敖汉苜蓿种子，比较分析种子劣变规律及生理特性的差异。结果表明：收获当年的敖汉苜蓿种子具有较高的硬实率，其抗逆性强，SOD、POD、CAT、MDA和脯氨酸含量最高，而发芽势和可溶性蛋白含量最低。贮藏起初2年，种子硬实率、不正常种苗数、死种子数、SOD、POD、CAT、MDA和脯氨酸含量降低，发芽率、发芽势和可溶性蛋白含量增加。随着贮藏时间的延长，种子可溶性蛋白含量降低，SOD、POD、CAT、脯氨酸和MDA积累量增加，种子质量下降，不正常种苗数和死种子数增多，种子活力下降。综合试验结果，贮藏2年有利于打破种子休眠，其种子质量最佳，种子发芽能力最强，但是种子抗逆性不高；贮藏1年存在轻度休眠，应进行打破硬实处理；贮藏3年的种子活力下降，其种用价值降低，不利于在人工草地建植中使用，生产中应贮藏2年后再播种效果较好。研究结果能较好地说明苜蓿种子在贮藏期间的活力变化，为我国人工草地建设中合理使用苜蓿种子提供理论依据。

紫花苜蓿； 贮藏； 种子生活力； 抗氧酶活性

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是全世界栽培面积最广的优质牧草，对畜牧业的发展起着至关重要的作用。作为遗传物质的载体，苜蓿种子质量在很大程度上决定了人工草场的成功建植。目前，室温贮藏仍是实际生产中保存种子的主要方式。研究表明，随着贮藏时间的延长，种子生理生化状态发生一系列的变化，从而导致种子活力的下降以及衰老死亡[1]。大部分研究发现，在种子老化过程中呼吸速率降低，膜通透性增加，氧化还原酶(如过氧化氢酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶等)活性降低，可溶性糖、可溶性蛋白含量降低，蛋白质、DNA、RNA合成能力下降，脱落酸增加，乙烯减少[2-4]。但是受种子发育期间的环境条件、遗传特性以及贮藏条件的共同作用，使得苜蓿种子的耐贮藏性与其它作物种子的耐贮藏特性不完全一致。

紫花苜蓿种子具有较高的硬实率，尤其在收获当年硬实率可达22%～77%[5-6]。在贮藏过程中，硬实种子的种皮限制水分和氧气的进入，防止微生物的侵染，能有效地保护种子的活力，有利于延缓种子劣变[7-8]。然而，在实际生产中，使用硬实率较高的种子会造成出苗时间长、出苗率低、出苗不整齐甚至出现严重的断垄缺苗现象，影响其种用价值。因此，在播种前应进行打破硬实处理。通常采用机械处理的方法破除硬实，但是，机械处理常常对种子造成伤害，带来一定的经济损失。研究表明，通过贮藏可降低苜蓿种子的硬实率[5-6]，但是应如何保存、保存多久其经济效益高，没有明确的结论。目前有关苜蓿种子贮藏方面的研究主要集中在不同保存方法及贮藏条件对种子活力的影响等[9-10]，而针对不同贮藏年限对苜蓿种子活力及生理生化影响的报道较少。

敖汉苜蓿(M.sativaL.cv Aohan)是在20世纪50年代由甘肃省引种到内蒙古赤峰市敖汉旗种植，经过多年的栽培驯化，成为适应当地气候土壤条件的一个地方品种。该品种抗旱、抗寒、抗风沙、耐瘠薄，在当地畜牧业发展中具有举足轻重的作用。因此，针对赤峰地区苜蓿产业发展的需求，本研究以自然贮藏条件下不同贮藏年限的敖汉苜蓿种子为研究对象，探讨贮藏时间对苜蓿种子活力及其生理特性的影响，为我国人工草地建设中合理使用苜蓿种子提供理论依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试紫花苜蓿品种为敖汉苜蓿，苜蓿种子分别于2012，2013，2014，2015年8月采集于内蒙古赤峰市，试验田不做任何施肥、灌溉处理。收获种子后室温贮藏，分别贮藏0，1，2，3年，于2015年9月进行实验。

1.2 测定内容与方法

1.2.1 种子发芽的测定

参照ISTA种子检验规程(2013)[11]进行发芽实验，将收获后的种子放入铺有2层湿润滤纸的培养皿中，每皿放置100粒种子，5 ℃预处理7 d，随后放置于光照培养箱中，在20 ℃恒温、光照8 h/黑暗16 h条件下培养，每个处理设4次重复。从第4天开始初次计数，逐日统计发芽种苗数，末次计数日为第10天，最终统计正常种苗数、不正常种苗数、硬实种子数和死种子数，并按以下公式计算发芽率和发芽势，最后求其平均值。

发芽率(%)=规定的发芽天数内发芽种子数和硬实种子数/供试种子总数×100%;

发芽势(%)=种子发芽数达到高峰时的发芽总数/供测种子粒数×100%;

硬实率(%)=硬实种子数/供测种子粒数×100%。

1.2.2 抗氧化酶的提取

参照Kibinza 等[12]的方法，略作修改。称取0.1 g苜蓿种子于预冷的研钵中研磨至粉末，加入3.5 mL提取液在15 000 g，4 ℃离心15 min，提取液包含0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.8)，2 mmol/L二硫代苏糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)，0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)，1.25 mmol/L PEG-4000和20% 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone，PVP)。所得上清液保存在4 ℃冰箱备用，以上所有操作均在1～4 ℃进行。

1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

采用氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)法[13]。1 mL总反应体系中含有50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.8)，13 mmol/L甲硫氨酸，75μmol/L NBT，2μmol/L核黄素，0.1 mmol/L EDTA 和0.5 mL粗酶液。反应液在光强约2 200 lx的荧光灯下反应20 min，反应温度为25 ℃。反应结束后以不照光的对照管做空白，调零，以光照后的对照管作为最大光还原管，用分光光度计在560 nm处测定吸光值。以每mg蛋白抑制NBT光化还原的50%作为一个酶活性单位(以U/mg protein表示)。

1.2.4 过氧化物酶(POD)活性测定

采用愈创木酚法[14]。取1 mL粗酶液加3 mL POD反应液(50 mL 0.1 mmol/L pH=6.0的磷酸缓冲液，28μL 愈创木酚，19μL 30% 过氧化氢)，25 ℃条件下反应，以加入3 mL反应液+1 mL磷酸缓冲液作为对照，用分光光度计在470 nm波长下测定反应液的吸光度，每隔2 s读数1次，共测3 min。以每分钟 OD值增加0.01为1个酶活性单位(以U表示)。

1.2.5 过氧化氢酶(CAT)活性的测定

采用紫外吸收法[15]。取100μL粗酶液加入3.4 mL磷酸缓冲液(25 mmol/L pH=7.0，混合0.1 mmol/L EDTA)，然后加入200μL 0.1 mol/L H2O2，用分光光度计在240 nm波长下测定反应液的吸光度，每隔2 s读数1次，共测2 min。反应由H2O2的加入启动，以每分钟 OD值减少0.01为1个酶活性单位(以U表示)。

1.2.6 丙二醛(MDA)含量的测定

MDA含量的测定参照Bailly等[15]的方法，略作改动。吸取0.95 mL粗酶液，加入1.5 mL蒸馏水和2.5 mL含0.5%硫代巴比妥酸的20%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶液，混合液于沸水浴中加热15 min，迅速冷却，以4 000 g离心10 min，上清液分别于532 nm和600 nm波长下测定光密度值。

1.2.7 脯氨酸含量的测定

采用酸性茚三酮法[16]。称取0.1 g紫花苜蓿种子用液氮研磨，加入 1 mL 3%磺基水杨酸溶液进行提取，之后置95 ℃水浴振荡提取10 min，取出试管冷却至室温后，10 000 g，25 ℃离心10 min，上清液为样品提取液。取0.5 mL上清液，参照苏州科铭生物技术有限公司生产的脯氨酸含量测定试剂盒说明书在520 nm波长下测定上层液吸光光度值，计算脯氨酸的含量，以μg/mg表示。

1.2.8 可溶性蛋白含量的测定

参照苏州科铭生物技术有限公司生产的考马斯亮蓝法测定蛋白含量试剂盒说明书进行。称取0.1 g紫花苜蓿种子用液氮研磨，加入1 mL酶提取液，8 000 g，4 ℃离心10 min，取200μL上清液加入1 mL考马斯亮蓝显色剂，室温静置10 min，于595 nm测定光密度值，蛋白质含量单位以mg/g 表示。

1.3 数据分析

采用Excel软件进行数据处理和作图，SPSS 21.0 统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏年限对敖汉苜蓿种子发芽的影响

收获当年，敖汉苜蓿种子硬实率较高，显著(plt;0.05)高于贮藏1年、2年和3年的种子(表1)，发芽势最低，显著(plt;0.05)低于贮藏1年、2年和3年的种子；贮藏1年后，解除了部分种子的硬实，降低了种子硬实率，其种子发芽率显著(plt;0.05)高于收获当年的种子和贮藏3年的种子，与贮藏2年的种子差异不显著(pgt;0.05)，发芽势显著(plt;0.05)高于收获当年的种子，显著(plt;0.05)低于贮藏2年的种子，与贮藏3年的种子差异不显著(pgt;0.05)，而不正常种苗数和死种子数显著低于收获当年和贮藏3年的种子，与贮藏2年的种子差异不显著(pgt;0.05)；贮藏2年后，解除了大部分种子的硬实，硬实率仅为8.75%，显著(plt;0.05)低于收获当年和贮藏1年的种子，与贮藏3年的种子差异不显著(pgt;0.05)，发芽率显著(plt;0.05)高于收获当年和贮藏3年的种子，与贮藏1年的种子差异不显著(pgt;0.05)，发芽势显著(plt;0.05)高于其它处理组，而不正常种苗数和死种子数显著低于收获当年和贮藏3年的种子，与贮藏1年的种子差异不显著(pgt;0.05)；随着贮藏年限的延长，苜蓿种子硬实率逐渐下降，贮藏3年后，种子硬实率仅为6.50%，在所有处理组中最低，显著(plt;0.05)低于收获当年和贮藏1年的种子，但发芽率和发芽势也逐渐下降，发芽率显著(plt;0.05)低于其它处理组，发芽势显著(plt;0.05)低于贮藏2年的种子，显著(plt;0.05)高于收获当年的种子，与贮藏1年的种子差异不显著(pgt;0.05)，而不正常种苗数和死种子数逐渐增加，显著(plt;0.05)高于其它处理组。

表1 不同贮藏年限对紫花苜蓿种子发芽的影响

不同年限发芽率(%)发芽势(%)硬实率(%)不正常种苗数死种子数089．50b30．35c53．80a3．70b6．80b196．00a74．75b21．00b2．75c1．25c296．50a87．75a8．75c2．25c1．25c384．25c77．00b6．50c5．25a10．50a

注:同列不同小写字母表示差异显著(plt;0.05)。

2.2 不同贮藏年限对敖汉苜蓿种子抗氧化酶活性的影响

紫花苜蓿种子抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)随着贮藏时间的延长呈现先降低后增加的趋势，以收获当年的种子为最高(图1)，贮藏1～2年后显著(plt;

注：不同小写字母表示差异显著(plt;0.05)。下同。图1 不同贮藏年限紫花苜蓿种子SOD、POD、CAT活性的变化

图2 不同贮藏年限紫花苜蓿种子MDA、脯氨酸和可溶性蛋白含量的变化

0.05)降低，但贮藏3年后迅速增加。其中POD活性下降的幅度最大，贮藏1年和2年的种子降幅分别为93.3%和94.36%，显著(plt;0.05)低于收获当年的种子，贮藏1年和2年间差异不显著(pgt;0.05)。贮藏3年后种子POD活性迅速增加，显著(plt;0.05)高于贮藏1年和2年的种子，但显著(plt;0.05)低于收获当年的种子；贮藏1年和2年的种子SOD活性降幅分别为40.27%和49.04%，显著(plt;0.05)低于收获当年的种子，贮藏2年的种子SOD活性显著(plt;0.05)低于贮藏1年的种子。贮藏3年的种子SOD活性迅速增加，显著(plt;0.05)高于贮藏1年和2年的种子，但显著(plt;0.05)低于收获当年的种子；贮藏1年和2年的种子CAT活性降幅分别为45.61%和52.53%，显著(plt;0.05)低于收获当年的种子，贮藏1年和贮藏2年的种子CAT活性差异不显著(pgt;0.05)。贮藏3年的种子CAT活性迅速增加，显著(plt;0.05)高于贮藏1年和2年的种子，与收获当年的种子差异不显著(pgt;0.05)。

2.3 不同贮藏年限对敖汉苜蓿种子内代谢产物含量的影响

紫花苜蓿种子MDA和脯氨酸含量随着贮藏时间的延长呈现先降低后增加的趋势，以收获当年的种子为最高(图2)，贮藏1～2年后显著(plt;0.05)降低，但贮藏3年后迅速增加。其中MDA含量的降幅较大，贮藏1年和2年的降幅分别为77.17%和80.16%，显著(plt;0.05)低于收获当年的种子，贮藏1年和贮藏2年间差异不显著(pgt;0.05)。贮藏3年的种子MDA含量迅速增加，显著(plt;0.05)高于贮藏1年和2年的种子，显著(plt;0.05)低于收获当年的种子；贮藏1年和2年的种子脯氨酸含量降幅分别为25.95%和41.06%，显著(plt;0.05)低于收获当年的种子，贮藏2年的种子脯氨酸含量显著(plt;0.05)低于贮藏1年的种子。贮藏3年的种子脯氨酸含量迅速增加，显著(plt;0.05)高于贮藏1年和2年的种子，但显著(plt;0.05)低于收获当年的种子。紫花苜蓿种子可溶性蛋白含量随着贮藏年限的增加呈现先增加后降低的趋势，贮藏1年和2年的种子增幅分别为68%和79%，显著(plt;0.05)高于收获当年和贮藏3年的种子。贮藏3年的种子可溶性蛋白含量显著(plt;0.05)降低，显著(plt;0.05)低于贮藏1年和2年的种子，与收获当年的种子差异不显著(pgt;0.05)。

3 讨论与结论

发芽率和发芽势是反映种子活力的重要指标，也是衡量种子质量的重要指标。而SOD、POD和CAT是防御系统中重要的保护酶，保护生物膜系统免受活性氧自由基损伤，活性越高，说明种子的抗逆能力越强。在本研究中，收获当年的紫花苜蓿种子硬实率和抗氧化酶活性最高，说明其抗逆能力强，但是发芽势最低。随着贮藏时间的延长，苜蓿种子硬实率逐渐降低，其抗氧化酶活性也降低，抗逆能力减弱，其中，贮藏2年的种子发芽率最高，发芽整齐度最好，不正常种苗和死种子也最少，说明硬实解除，有利于田间种植和出苗，但是抗氧化酶活性最低。因此，硬实率高的种子其抗逆能力强，耐贮藏，而发芽率高并不代表其耐受性强。贮藏3年后，种子发芽率下降，硬实种子减少不正常种苗数和死种子数增多，进而使种子质量和活力逐渐下降，从而诱导抗氧化酶活性的增加。说明苜蓿种子尽管可以多年贮藏，但其耐受性降低，种子劣变加速。孔令琪等[17]研究不同硬实程度的苜蓿种子在老化过程中生理生化特性的变化情况，结果表明，经老化处理后，解除部分硬实，从而提高种子发芽率，但SOD、CAT活性下降，表明苜蓿种子耐受性与种子硬实程度呈正相关，与本研究结果一致。

可溶性蛋白含量可近似表示细胞渗透浓度和功能蛋白的含量，可以为种子的发芽提供氮素，有助于维持细胞正常代谢。多数研究结果表明，随着种子老化的加剧，种子内的可溶性蛋白含量下降[18-19]。在本研究中，随着苜蓿硬实种子的减少，可溶性蛋白含量逐渐增加，但贮藏3年时，种子老化程度加剧，可溶性蛋白含量也随之降低。曹帮华等[7]研究不同硬实程度刺槐种子的活力差异表明，其可溶性蛋白含量随着硬实程度的增加而增加，与本研究结果一致。脯氨酸是植物体内有效的渗透调节物质，当植物遭受逆境胁迫时积累脯氨酸，从而降低细胞渗透势，保护代谢酶的活性[20-21]。在本研究中，收获当年的苜蓿种子脯氨酸含量最高，表明其抗逆性最强，但是随着贮藏时间的延长，种子内脯氨酸含量呈现先降低后增加的趋势，表明随着贮藏时间的延长，苜蓿种子抗逆性逐渐降低。当贮藏3年时，种子老化速度加剧，种子活力下降，通过提高细胞内的脯氨酸含量来维持细胞的渗透压，增强种子的抗逆能力。

MDA是脂质过氧化的最终产物，它对种子具有毒害作用，其含量的高低可反映出细胞膜受损伤的程度，而脂质过氧化是种子老化的主要原因之一[22]。大量研究表明，老化种子的MDA含量显著增加[23-24]。在本研究中贮藏3年的苜蓿种子MDA积累量增加，其发芽率和发芽势降低，而不正常种苗数和死种子数增多，说明脂质过氧化作用加剧，种子老化速度加速，而此时SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性增加，有利于清除活性氧和自由基，减轻膜脂过氧化作用，从而保持种子活力。

种子的衰老伴随着种子活力的下降。在本研究中，种子质量的变化及生理生化指标的变化能很好地说明苜蓿种子在贮藏期间生活力的变化。由于紫花苜蓿种子存在较高的硬实率，在一定的贮藏时期内种子的老化程度缓慢，具有一定的安全贮藏期，当贮藏时间超过安全贮藏期，苜蓿种子的老化速度加剧，其生活力也随之下降。综上所述，贮藏2年有利于打破种子休眠，其种子质量最佳，种子发芽能力最强，但是种子活力不高；贮藏1年存在轻度休眠，应进行打破硬实处理；当贮藏时间达到3年时，种子劣变程度加剧， 活力下降，其种用价值降低。

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Study on Viability and Physiological Characteristics of Aohan AlfalfaSeeds with Different Storage Time

CHENLingling1,2,CHENGHang1,ZHANGYangyang1,ZHANGYe1,WANGSiqi1,MAOPeisheng1

(1.Department of Grassland Science,China Agricultural University,Beijing Key Laboratory of Grassland Science,Beijing 100193,China;2.Chifeng Academy of Agricultural and Animal Sciences,Chifeng Inner Monglia 024031,China)

Storage of alfalfa seeds affects their qualitative traits.During the storage,seed vigor decreased and physiological characteristics changed with the extension of storage time.To investigate the effect of storage time on viability and physiological characteristics of alfalfa (MedicagosativaL.)seeds,alfalfa seeds cv Aohan with 0-3 storage years were evaluated.The significant increase of germination potential and the content of soluble protein were observed at one and two year storage periods.The number of hard seeds,abnormal seedlings and dead seeds,activities of superoxide dismutase (SOD)，peroxidase(POD)，catalase(CAT),and the content of malonaldehyde(MDA) and proline were decreased significantly after storage for two years at room temperature.After three-year period,the germination percentage,germination potential and the content of soluble protein were decreased significantly,and the number of abnormal seedlings and dead seeds,activities of superoxide dismutase(SOD)，peroxidase(POD)，catalase(CAT),and the content of malonaldehyde(MDA)and proline were increased significantly.It is concluded that the hard seed content is a very important parameter connected with changes of seed viability during storage period.Seeds stored for 0 year had higher hard seed content and viability;seeds stored for 1 year were still existence higher hard seed rate;seeds stored for 2 years had the higher seed quality;seeds stored for 3 years started to lose their viability.Therefore,alfalfa seeds with 2 storage years can be used in production.

alfalfa; storage; seed viability; antioxidase

2016-11-09

现代牧草产业技术体系(CARS-35)资助。

陈玲玲(1982—)，女，内蒙古赤峰人；在读博士研究生，主要从事牧草种子生理与良种扩繁研究；E-mail:chenlingling001@126.com。

毛培胜(1970—)，男，内蒙古锡林浩特人；教授，博士，主要从事牧草种子生理与良种扩繁研究；E-mail:maops@cau.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.023

S 551+.7

A

1001-4705(2017)03-0023-06