仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析

吴学敏 ， 陈秋勇 ， 陈如敬 ， 王隆柏 ， 车勇良 ， 王晨燕 ， 严 山 ， 刘玉涛 ， 周伦江

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 ， 福建 福州 350013)

仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析

吴学敏 ， 陈秋勇 ， 陈如敬 ， 王隆柏 ， 车勇良 ， 王晨燕 ， 严 山 ， 刘玉涛 ， 周伦江

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 ， 福建 福州 350013)

为了研究福建省闽北地区某猪场猪大肠杆菌的耐药情况，通过采集32份发生仔猪黄、白痢的粪便，经麦康凯琼脂培养基分离培养，再经普通肉汤纯培养，用镜检方法、PCR扩增方法和生化试验进行鉴定，结果共分离到29株大肠杆菌。生化试验结果表明，分解甘露醇、葡萄糖、乳糖和麦芽糖产酸产气，V-P试验为阴性，M.R.试验呈阳性，硫化氢试验阴性，枸橼酸盐试验阴性，吲哚试验阳性，硝酸盐试验阳性。药敏试验结果显示，分离的大部分菌株对四环素、林可霉素、先锋霉素Ⅳ耐药；大多数菌株对多黏菌素B、复方新诺明和痢特灵高度敏感。该研究为当地猪场临床用药提供参考，为猪大肠杆菌病的预防控制提供理论依据。

大肠杆菌 ； 分离 ； 鉴定 ； 敏感性

大肠杆菌是自然界中一种最常见的革兰阴性菌，普遍存在于环境中，在猪的肠道中与猪属于共生情况。仔猪大肠杆菌性的腹泻拉稀，即俗称仔猪黄、白痢，是由产肠毒素性大肠杆菌引起的高度接触性、致死性传染病。此类引起仔猪消化道疾病的致病性大肠杆菌，能产生许多种毒素引起仔猪发病，如肠毒素、内毒素、神经毒素和致水肿毒素等，其中肠毒素是造成腹泻的主要因素。由于致病性大肠杆菌血清型的不同和猪的年龄、体质、免疫状态等差异，可分为仔猪黄痢、仔猪白痢。仔猪黄痢为小猪出生后1周龄内所发生的，仔猪白痢为2～3周龄仔猪发生的腹泻，均是猪场中最常见的传染病，猪场一旦有发生就很难根除，发病小猪即使有耐过，也会严重影响仔猪的生长，因此给养猪业造成严重经济损失。本试验以福建省闽北地区某猪场的仔猪腹泻为研究对象，对致病性大肠杆菌进行分离、鉴定及药物敏感性的研究分析，以期对当地猪场大肠杆菌性腹泻的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集与处理 2017年2月福建省闽北地区某猪场哺乳仔猪发生黄、白痢，以高压灭菌棉签拭子，随机采集32份正在患病哺乳仔猪的肛门试样，于5 mL的LB培养基，37 ℃ 160 r/min振荡培养4 h。

1.2 细菌分离纯化 将初培养的菌液画线接种麦康凯琼脂平板，37 ℃培养18 h，观察菌落形态。并挑取单个红色菌落接种于普通营养肉汤，37 ℃ 160 r/min振荡培养12 h。将扩繁培养好的菌液4 ℃存放，用于PCR和生化试验鉴定及药物敏感性分析。

1.3 PCR方法鉴定 针对大肠杆菌16S rRNA保守序列设计一对引物， 送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为328-F：5′-TGAAGCGACCTGCACTCATT-3′；328-R：5′-CGGGTCAGTGGCAAGGTTAT-3′。再进行PCR条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验。PCR反应总体积为25 μL：2×GoTaqMaster Green Mix 13.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，无菌去离子水补充至终体积为25 μL。反应条件为：94 ℃预变性10 min后进入循环，循环参数为94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环后72 ℃延伸10 min。反应结束，取5 μL反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳，拍照观察结果。

1.4 生化试验 将符合大肠杆菌形态特征及PCR鉴定为阳性的细菌，接种于生化试验微量发酵管(葡萄糖、棉子糖、甘露醇、尿素、枸橼酸盐、葡萄糖磷酸盐、赖氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、半固体琼脂、硫化氢、山梨醇、蛋白胨水、木糖、侧金盏花醇)，37 ℃培养24 h，观察并记录结果。

1.5 药敏试验 用高压灭菌的棉签蘸取已鉴定好的猪大肠杆菌菌液，均匀涂布到肉汤琼脂平板的表面。选取以下10种常用的抗生素:庆大霉素、链霉素、强力霉素、四环素、多黏菌素B、丁胺卡那霉素、复方新诺明、先锋霉素Ⅳ、痢特灵、林可霉素，贴到这些琼脂平板的表面，37 ℃培养18 h后，观察测量抑菌圈的大小。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离鉴定结果 初培养菌液画线于麦康凯琼脂平板上培养的特征：形成红色、圆形、隆起、光滑湿润、边缘整齐的中等大菌落；取培养物涂片进行革兰染色，镜检能见到革兰阴性、两端钝圆的红色短杆菌。此次从32个样品中共分离到29株此类细菌。

2.2 PCR鉴定结果 将在麦康凯培养基上具有大肠杆菌生长特性的29株菌进行PCR鉴定，提取的DNA为模板均能扩增到约328 bp大小的条带(如图2所示)，将扩增的产物送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序，结果与网上公布的E.coli16S-rDNA序列同源性为100%～98.8%，可初步判定此次用仔猪肛门拭子分离到的29株菌均为大肠杆菌。

图1 麦康凯琼脂培养

图2 部分菌株的PCR结果

2.3 生化鉴定结果 将分离的29株细菌进行生化试验鉴定，分解甘露醇、葡萄糖、乳糖和麦芽糖产酸产气，绝大部分能分解阿拉伯糖，部分能分解蔗糖，V-P试验为阴性，M.R.试验呈阳性，硫化氢试验阴性，枸橼酸盐试验阴性，吲哚试验阳性，硝酸盐试验阳性。生理生化试验结果(见表1)均符合大肠杆菌的特征。

2.4 药敏试验结果 对分离到的29株猪源大肠杆菌进行药物敏感性分析。药物敏感性判定标准为：抑菌圈直径15.1～20 mm者为高度敏感；直径 10.1～15 mm者为中度敏感；直径在10 mm以下者为耐药。试验结果显示：大部分菌株对先锋霉素Ⅳ(26/29)、林可霉素(27/29)、四环素(26/29)耐药；部分菌株对丁胺卡那霉素(15/29)和强力霉素(16/29)中度敏感；绝大多数菌株对复方新诺明(25/29)、痢特灵(27/29)和多黏菌素B(26/29)高度敏感。部分菌株的药敏结果如表2所示。

3 讨论

仔猪黄、白痢主要是由致病性猪大肠杆菌引起的初生仔猪的一种急性、高致死性传染病，感染发病对象主要是7日龄以内仔猪，1～3日龄的仔猪一旦感染，发病率可达90%以上，发病死亡率为30%～70%，发病率随日龄增长而降低，临床典型症状为剧烈腹泻、排黄色或者灰白色水样粪便，带有小气泡及腥臭味，死亡原因以拉稀脱水死亡为主。

表1 部分菌株生化试验结果

+：阳性；—：阴性；⊕：阳性并产酸、产气

表2 部分菌株药敏试验结果

S：高度敏感；I：中度敏感；R：耐药

2017年2月本试验研究通过福建省闽北地区某猪场哺乳仔猪发生黄、白痢，以高压灭菌棉签拭子，随机采集32份正在患病哺乳仔猪的肛门试样，从中分离到29株猪大肠杆菌。通过革兰染色镜检为革兰阴性菌，在麦康凯琼脂平板上培养均符合大肠杆菌的生长特性，PCR结果和生化试验结果表明分离的29株菌株确为大肠杆菌。药物敏感性试验结果表明，此次分离的大多数菌株对多黏菌素B、复方新诺明和痢特灵高度敏感；大部分菌株对四环素、林可霉素、先锋霉素Ⅳ耐药；部分菌株对丁胺卡那霉素和强力霉素中度敏感。在养殖生产中，由于用药不规范、疗程不当等因素，如长期使用同一类药物，或者长期在饲料、饮水中加入预防性用药，均可使细菌产生抗药性[2-3]。在猪场中药物的使用应遵循以下原则：严格避免滥用抗菌药、确定有效的剂量和疗程；严格遵守抗菌药物局部使用、预防应用、饲料添加及联合使用的相关原则；合理的分期轮换使用抗菌药；根据细菌耐药机制和抗菌药结构的关系，寻找中草药来代替抗生素药物；安排合理的疫苗免疫，代替对药物保健的长期依赖[4-5]。

4 结论

本试验随机采集32份正在患病哺乳仔猪的肛门拭样，从中分离到29株猪大肠杆菌，可反应该猪场仔猪拉稀主要病因为大肠杆菌引起。本研究中分离的大部分菌株对四环素、林可霉素、先锋霉素Ⅳ耐药；部分菌株对丁胺卡那霉素和强力霉素中度敏感；大多数菌株对多黏菌素B、复方新诺明和痢特灵高度敏感。本研究结果对当地猪场临床上正确、合理地选用抗菌药物有一定参考意义。

[1] 沈莉萍,徐锋,王建.上海地区猪源大肠杆菌血清型及其毒力因子分布调查[J].畜牧与兽医,2014,46(8):94-97.

[2] 马长宾,陈文武,陈海军,等．规模化猪场仔猪源大肠杆菌血清型调查及耐药性检测[J].畜牧与兽医,2016,48(3):27-32.

[3] 李淑红,王京仁,成钢. 猪大肠杆菌和葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国畜牧兽医, 2012, 39(8):195-198.

[4] 成大荣,高小攀,朱善元,等. 仔猪大肠杆菌性腹泻的病原检测与免疫防制[J]. 甘肃农业大学学报,2010,45(2):30-33.

[5] 万喜太,杨多学.仔猪大肠杆菌病综合防治[J].甘肃畜牧兽医,2005,35(1):28-29.

IsolationandIdentificationofEscherichiacolifromPigletsandAnalysisofDrugSensitivity

WU Xue-min , CHEN Qiu-yong , CHEN Ru-jing , WANG Long-bai , CHE Yong-liang , WANG Chen-yan , YAN Shan , LIU Yu-tao , ZHOU Lun-jiang

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agriculture Sciences Fujian Animal Disease Control Technology Development Center, Fuzhou 350013, China)

In order to study the resistance of pigEscherichiacoliin a pig farm in northern of Fujian Province, we collected feces samples of 32 piglets that had yellow and white diarrhea. The Samples were separated and cultivated by McCain，and cultured by ordinary broth. The results showed that 29 strains ofEscherichiacoliwere isolated by microscopic method, PCR amplification method and biochemical test. The results of biochemical tests showed that they decomposed mannitol, glucose, lactose and maltose, and produced acid and gas; VP test was negative; MR test was positive; cyanide sulfide test was negative; citrate test was negative; indole test was positive; nitrate test was positive. The results of drug allergy testing showed that most strains were resistant to tetracycline, lincomycin, and cephalosporin IV, and were highly sensitive to polymyxin B, cotrimoxazole and furazolidone. The results of the study provide a reference for the clinical use in pig farms, and provide the theoretical basis for the prevention and control of porcine colibacillosis.

Escherichiacoli; Isolation ; Identification ; Sensitivity

ZHOU Lun-jiang

R378.2+1

A

0529-6005(2017)10-0086-03

2017-05-12

福建省公益类科研院所专项(2015R1023-10)

吴学敏(1984-)，男，助理研究员，硕士，研究方向为动物流行病学，E-mail：wxm0593@126.com

周伦江，E-mail:lunjiang@163.com