三疣梭子蟹HMGBa基因克隆及其应答不同病原入侵的表达特征

三疣梭子蟹HMGBa基因克隆及其应答不同病原入侵的表达特征

为研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)高迁移率族蛋白B (High-mobility group box protein,HMGB)在其先天免疫中发挥的功能, 利用RACE技术首次克隆得到了三疣梭子蟹HMGBa基因, 命名为PtHMGBa。其cDNA序列全长1030 bp, 其中5′端非编码区(UTR)为94 bp, 3′端非编码区(UTR)为255 bp, 开放阅读框(ORF)为681 bp, 编码一个含有227个氨基酸, 分子量25.82 kD, 理论等电点为5.94的蛋白质。PtHMGBa蛋白包含2个HMG盒结构域和一个酸性尾部结构域。分析表明, 三疣梭子蟹HMGBa氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) HMGBa相似度最高。实时荧光定量PCR结果显示,PtHMGBa基因在血细胞和肝胰腺的表达量最高, 在眼柄中表达量最低。在副溶血弧菌和WSSV感染过程中,PtHMGBa基因在肝胰腺和血细胞中均出现了表达上调。其中, 经副溶血弧菌感染后, 该基因在上述2种组织中分别于48h和6h达到表达量的峰值; 经WSSV感染后, 该基因在2种组织中均在12h达到表达量的峰值。结果表明PtHMGBa基因参与了三疣梭子蟹抵御外来病原的免疫响应, 研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理提供了科学依据。

三疣梭子蟹; 高迁移率蛋白B; 基因克隆; 先天免疫; 表达分析

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济动物, 在中国、朝鲜、日本等海域均有分布, 在我国黄渤海及东海分布尤为广泛, 其肉质鲜美, 营养丰富, 是我国重要的海水养殖品种之一[1,2]。但随着养殖规模的不断扩大, 苗种质量参差不齐, 再加上水体环境恶化, 造成其病害也日趋严重, 给养殖产业带来了巨大的经济损失。有研究表明, 在虾蟹混养池中, 三疣梭子蟹也可感染对虾白斑综合征病毒(WSSV)并造成三疣梭子蟹组织病变乃至死亡[3]。另外, 副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)也可造成三疣梭子蟹感染发病, 表现为游动迟缓、肝胰腺色淡、鳃混且附有污物等症状[4]。然而, 三疣梭子蟹等无脊椎动物没有类似于哺乳动物的B淋巴细胞和T淋巴细胞, 不能产生抗体, 因此也不具有获得性免疫系统[5], 但其具有独特的先天性免疫系统, 可以通过免疫信号通路级联反应清除入侵机体的病原微生物。

高迁移率族蛋白(High-mobility group protein,HMG protein)最初在牛胸腺中被发现, 因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率快而得名。HMGB蛋白是一种典型的HMG家族蛋白, 在调节DNA重组、修复、复制和基因转录方面均起着重要作用[6]。近来研究发现, 脊椎动物中的HMGB1可由凋亡细胞或经IL-1β等炎症因子激活的细胞释放到细胞外[7—9],并与先天免疫信号通路TLR家族中的TLR2、TLR4、TLR9等受体结合[10—12], 调节多种免疫炎症反应。HMGB蛋白有着典型的结构域, 即位于蛋白N端及中部的2个HMG盒结构域和1个C端富含酸性氨基酸的尾部结构域[13]。

目前对HMGB家族基因的研究大多在脊椎动物中, 在无脊椎动物, 特别是甲壳动物中的研究较少, 仅有凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的LvHMGBa、LvHMGBb基因被克隆, 结果表明经WSSV感染后,LvHMGBa和LvHMGBb均出现了表达上调[14]。然而, HMGB家族基因在三疣梭子蟹免疫调控中发挥的功能还未见文献报道。我们利用RACE技术首次克隆出了三疣梭子蟹HMGBa基因的cDNA全长序列, 命名为PtHMGBa, 并且对其序列进行了分析, 阐明了其系统进化关系。利用实时荧光定量PCR检测副溶血弧菌和WSSV感染后三疣梭子蟹肝胰腺和血细胞中PtHMGBa的表达变化,旨在为进一步研究三疣梭子蟹PtHMGBa基因在先天免疫中发挥的作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的三疣梭子蟹均取自中国水产科学研究院黄海水产研究所实验基地山东省昌邑市海丰水产养殖有限责任公司, 体重为(33.5±3) g, 放置于整理箱(560 mm×360 mm×280 mm)中暂养7d,水温保持在(20±2)℃、盐度33, pH 8.2。暂养期间持续充氧, 每天换水清污, 换水量为原水量的1/3,每天定时投喂饵料, 保留活力形态均较好的个体。

1.2 RNA的提取及RACE第一链合成

用Trizol法分别提取三疣梭子蟹各组织总RNA,采用紫外分光光度计与琼脂糖凝胶电泳等方法, 将提取得到的总RNA进行质量和完整性检测。按照SMARTTMRACE Amplification Kit (Clontech)说明书的方法, 选取质量及完整性均较好的肝胰腺组织总RNA用来合成3′和5′ RACE第一链, 用于后续实验。

1.3 三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA序列全长的克隆

根据本实验室转录组库中所得到的三疣梭子蟹HMGBa基因EST序列, 利用Premier 5.0软件分别设计3′和5′末端特异性引物(表1), 由擎科梓熙生物技术有限公司进行合成。参照SMART RACE说明书, 利用Advantange 2 PCR Kit (Clontech)使UPM与相应的特异性引物分别与模板结合, 进行三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA 3′和5′末端扩增。PCR程序设为: 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 90s, 30个循环。扩增产物用Nucleo Spin Gel and PCR Clean-Up试剂盒(TaKaRa)切胶回收得到目的片段。将目的片段和pMD 19-T进行载体连接, 16℃反应3h, 将连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 涂平板后37℃培养12h。挑取阳性菌落在加入AMP的LB液体培养基中培养5h, 随后进行菌液PCR检测, 测序由擎科梓熙生物技术有限公司完成。

1.4 三疣梭子蟹HMGBa基因的生物学分析

利用ContigExpress Project软件去掉载体序列保留目的片段序列, 将所得到的目的片段序列与三疣梭子蟹HMGBa基因EST序列拼接后得到三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA序列全长。通过BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将得到的三疣梭子蟹HMGBa基因的cDNA序列进行同源性比对。利用EditSeq和Gene Tool预测开放阅读框(ORF)并翻译得到其氨基酸序列。氨基酸序列分子量及等电点用在线ExPASy进行预测, 利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)进行蛋白质功能结构域预测与分析。利用DNAMAN将三疣梭子蟹HMGBa氨基酸序列和其他物种相应氨基酸序列进行多重序列比对, 使用MEGA 5.0软件构建Neighbor-Joining系统进化树, 对三疣梭子蟹HMGBa基因的亲缘关系分析。

1.5 病原感染实验

将实验所用三疣梭子蟹暂养7d后分为2个实验组和1个对照组, 即副溶血弧菌感染组、WSSV感染组、PBS对照组, 每组80只三疣梭子蟹。3组三疣梭子蟹分别注射100 μL副溶血弧菌(2.6×107CFU/mL)、WSSV (3.2×107拷贝/mL)和PBS, 实验期间的饲养和管理与暂养期保持一致。分别于0、3h、6h、12h、24h、48h和72h进行取样, 3只设为1个平行, 取其肝胰腺、血淋巴等组织。将所取血淋巴4000 r/min离心15min, 去血清保留血细胞后立即加入300 μL Trizol, 和所取其他组织整理分类后置于液氮中保存, 以便后续分析。

1.6 三疣梭子蟹HMGBa基因的定量表达分析

将三疣梭子蟹血细胞、肝胰腺、鳃、肌肉、心脏、眼柄、表皮、胃、肠等组织以及不同感染时间点所取组织分别提取RNA, 用核酸定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性, 确保RNA质量与完整性均好, 随后用Prime Script RT reagent Kit进行反转录合成cDNA, 具体方法按照说明书进行。

根据本实验中已经得到的三疣梭子蟹HMGBa基因的开放阅读框cDNA序列, 设计合成一对正反向特异荧光定量引物, 并且以内参基因β-actin作为对照(β-actin-F和β-actin-R、HMGBa-F和HMGBa-R)(表1)。参照SYBR Premix ExTaqTMⅡ说明书,利用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR仪分析三疣梭子蟹血细胞、肝胰腺、鳃、肌肉、心脏、眼柄、表皮、胃、肠等组织以及不同感染时间点所取血细胞、肝胰腺等组织中HMGBa基因的相对表达量。设置反应体系为10 μL, 包括5 μL SYBR Premix ExTaqTMⅡ、0.4 μL 10 μmol/L的正反向引物、0.2 μL ROX Reference DyeⅡ、1.0 μL cDNA和3.0 μL灭菌双蒸水。设置反应程序为: 95℃ 30s;95℃ 5s, 60℃ 34s, 40个循环; 95℃ 15s, 60℃ 1min,95℃ 15s。各样本均设置3个重复, 实验结果采用相对标准曲线法2–ΔΔCt[15]进行相对定量计算, 并利用SPSS 19.0软件对结果进行单因素方差分析(Oneway, ANOVA), 并对其显著性进行检验(P＜0.05表示具有差异显著,P＜0.01表示具有极显著差异)。

2 结果

2.1 三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA的克隆及其序列分析

将提取得到的三疣梭子蟹各组织总RNA, 用核酸定量仪和琼脂糖凝胶电泳对其质量和完整性进行检测, 结果显示其A260/A280都在1.9—2.0, 28S、18S和5S rRNA条带均清晰完整, 根据检验结果可知实验所提总RNA质量较好, 可用于合成RACE模板。利用合成的cDNA第一链作为模板, 进行5′和3′末端RACE扩增。PCR产物交由公司测序, 根据已知的EST序列分析比较测序结果, 拼接得到三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA全长序列, 利用EditSeq软件以及BLAST分析序列后, 发现已知序列包含完整的开放阅读框(ORF), 表明所得到的基因序列完整可靠。三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA序列(Gen-Bank登录号KY242487)全长1030 bp, 包含681 bp的开放阅读框(ORF)、94 bp的5′端非编码区(UTR)和255 bp的3′端非编码区(UTR), 3′末端具有一个由22个腺嘌呤核苷酸组成的poly (A)尾以及一个多聚腺苷酸信号序列(Polyadenylation signal) AATAAA。

2.2 氨基酸序列分析

使用EditSeq软件以及ExPASy预测得到三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA序列开放阅读框(ORF)长为681 bp, 编码一个由227个氨基酸组成的分子量为25.82 kD, 理论等电点为5.94的蛋白。利用SMART和InterproScan对三疣梭子蟹HMGBa基因进行在线蛋白质功能结构域分析, 结果表明, 其分子内具有2个70个氨基酸左右的HMG盒子结构域, 分别为位于15—87位的A盒和位于110—180位的B盒。另外,在分子的C端还具有一个富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性尾部结构(Acidic tail)。

2.3 同源性及系统进化分析

通过BLAST同源性比对分析, 发现三疣梭子蟹HMGBa氨基酸序列与凡纳滨对虾HMGBa基因的同源性最高为76%, 其次与凡纳滨对虾HMGBb、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)等昆虫类同源性较高。

通过利用MEGA5.0软件对三疣梭子蟹HMGBa基因进行系统进化分析, 三疣梭子蟹HMGBa基因与凡纳滨对虾HMGBa基因亲缘关系最近, 其次与凡纳滨对虾HMGBb、脐橙螟(Amyelois transitella)、黑腹果蝇等无脊椎动物的亲缘关系较近, 与斑马鱼(Danio rerio)、 智人(Homo sapiens)、 小家鼠(Mus musculus)等脊椎动物亲缘关系较远。由系统进化树可以看出, 10个不同物种的HMGB家族基因明显聚为两个类群(图1)。

2.4 三疣梭子蟹HMGBa基因的组织定量表达分析

利用实时荧光定量PCR技术, 以三疣梭子蟹βactin基因作为内参, 对三疣梭子蟹HMGBa基因在不同组织的表达差异情况进行分析, 结果显示, 三疣梭子蟹HMGBa基因在各组织中均有一定表达,其中在血细胞、肝胰腺中的表达量最高, 分别为眼柄表达量的25.7和24.0倍(P＜0.01), 在肠和心脏中也有相对高的表达量, 而在眼柄中的表达量最低(图2)。

图2 三疣梭子蟹HMGBa基因在不同组织中的表达分布状况Fig. 2 Expression of HMGBa gene in different tissues of P.trituberculatus

2.5 病原感染对三疣梭子蟹肝胰腺、血细胞HMGBa基因mRNA表达的影响

经分析发现: 与对照组相比, 经副溶血弧菌感染12h后,PtHMGBa基因在肝胰腺中出现显著上调(P＜0.05), 且在48h表达量最高, 为对照组的4.2倍。然而在血细胞中PtHMGBa基因在6h出现表达量的峰值, 为对照组的3.5倍; 并在达到峰值后, 维持在相对高表达的水平(图3)。经WSSV感染后,PtHMGBa基因在肝胰腺和血细胞中均在12h显著上调(P＜0.05)并且达到了表达量的峰值, 但在血细胞中的表达差异更为明显(图4)。

另外, 根据本实验的结果, 与WSSV感染组相比经副溶血弧菌感染后, 三疣梭子蟹HMGBa基因的表达变化更加明显。

3 讨论

先天性免疫包括体液免疫和细胞免疫, 作为一种古老且有效的免疫防御机制, 能够有效抵御外来病原的入侵, 诱导快速有效的免疫应答反应[16,17]。HMGB家族蛋白作为一种具有多功能的染色体结合蛋白, 在多种细胞和组织中都有较高的表达, 作为一种DNA伴侣蛋白与染色体相互作用[18], 但HMGB蛋白也可以转运到细胞质中[19], 激活免疫系统, 诱导免疫级联反应, 参与多种免疫炎症反应, 清除外源病原菌等异物[20]。已有研究表明, 哺乳动物HMGB1还可以通过与Toll样受体相互作用从而激活免疫炎症反应[21,22]。HMGB家族基因在脊椎动物特别是哺乳动物中已经有了较为深入的研究, 但在无脊椎动物特别是甲壳动物中涉及较少, 目前仅Chen等[14]克隆得到凡纳滨对虾HMGBa、HMGBb基因, 并对其功能进行了研究。

图3 副溶血弧菌感染后三疣梭子肝胰腺和血细胞中HMGBa基因的表达差异Fig. 3 The expression of HMGBa gene in P. trituberculatus hepatopancreas and haemocytes after V. parahaemolyticus infection

图4 WSSV感染后三疣梭子肝胰腺和血细胞中HMGBa基因的表达差异Fig. 4 The expression levels of HMGBa gene in P. trituberculatus hepatopancreas and haemocytes after WSSV infection

本研究通过RACE技术获得三疣梭子蟹HMGBa基因cDNA序列的全长(GenBank登录号:KY242487)。通过与其他物种进行同源性比对发现, 三疣梭子蟹HMGBa的蛋白序列与凡纳滨对虾HMGBa序列相似度最高, 为76%。三疣梭子蟹HMGBa基因包含2个HMG盒结构, 分别为靠近蛋白N端的A盒和位于分子中部的B盒, 其中A盒由73个氨基酸组成, B盒由71个氨基酸组成, 2个盒结构具有相似的分子构象且十分保守。另外具有一个位于C端的由24个氨基酸组成的酸性尾部结构, 这与已知的HMGB家族基因结构特征一致, 已有文献报道, C端的酸性尾部结构在HMGB家族蛋白的转录过程及转运到细胞质的过程均起了重要作用[23,24]。基于以上分析, 我们认为可以确定本实验新克隆得到的HMGBa基因是HMGB家族在三疣梭子蟹中的同源基因。

已有研究表明, 胞外的HMGB1蛋白可以调控多种免疫炎症反应, 是一种重要的晚期炎症介质,参与多种疾病的进程[25]。Yang等[26]克隆得到了草鱼HMGB1基因, 发现草鱼HMGB1蛋白可以使I型干扰素上调, 表明其在先天免疫防御中起到了重要的作用。Chen等[14]通过WSSV感染凡纳滨对虾, 利用实时荧光定量检测LvHMGBa和LvHMGBb基因在肝胰腺中表达量的变化, 发现均出现了表达量上调的现象, 并于24h出现峰值, 分别达到了对照组的7倍和4倍。另外, 这2个基因还可与LvDorsal和LvSTAT相互作用, 从而影响凡纳滨对虾的先天免疫[14]。在本实验中, 我们选取了副溶血弧菌和WSSV2种病原分别对三疣梭子蟹进行感染, 在感染的过程中我们发现, 随着感染时间的延长, 梭子蟹出现了行动迟缓、不进食等现象。副溶血弧菌感染后,PtHMGBa基因在肝胰腺和血细胞中均显著上调,分别于48h和6h达到其峰值, 达到了对照组的4.2和3.5倍; 经WSSV感染后,PtHMGBa基因在肝胰腺和血细胞中同样的出现了表达上调的现象, 均在12h表达量最高, 分别达到了对照组的1.8和2.3倍, 这一实验结果与Chen等[14]利用WSSV感染凡纳滨对虾得出的结果相类似。据此我们推测, 三疣梭子蟹HMGBa基因可能在机体抵御病原入侵时被诱导表达, 参与免疫炎症反应。比较这2种病原感染后对三疣梭子蟹HMGBa基因表达量的变化, 我们发现,经副溶血弧菌感染后,PtHMGBa基因表达上调更为显著, 特别是经WSSV感染后PtHMGBa基因在三疣梭子蟹肝胰腺中的变化相对较小。经副溶血弧菌感染后, 三疣梭子蟹的死亡时间多在6—48h, 但同期受到WSSV感染的三疣梭子蟹的死亡数量较少, 由此我们推测, WSSV在三疣梭子蟹体内的潜伏期较长, 因此PtHMGBa的表达量也相对上调幅度不大。相对于WSSV, 三疣梭子蟹对副溶血弧菌的入侵更为敏感, 能在短期内刺激PtHMGBa基因的较大量表达。

综合以上结果得出: 三疣梭子蟹HMGBa基因的表达可被不同病原的刺激所诱导, 从而在宿主抵抗病原入侵感染的过程中发挥作用。作为先天免疫中的一种重要的调控因子, 三疣梭子蟹HMGBa基因在抵御不同病原时入侵时出现的表达量的差异原因还需要进一步探究。

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CLONING OF HMGBA IN PORTUNUS TRITUBERCULATUS AND ITS EXPRESSION IN RESPONDING TO BACTERIAL AND VIRAL INFECTIONS

ZHANG Jie1,2, LÜ Jian-Jian1,3, LIU Ping1,3, LI Jian1,3, WANG Zhu-Qing1,2and ZHANG Xiao-Hui1,2
(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Laboratory for Marine Fisheries and Aquaculture,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266071, China)

Portunus trituberculatusis an economically important aquaculture species in China. As crustacean, it is lack of adaptive immunity and can induce effective immune responses to resist pathogen relying on innate immunity.Vibrio parahemolyticusand white spot syndrome virus (WSSV) have caused significant economic damage toP. trituberculatusaquaculture. High mobility group box (HMGB) proteins are known to be involved in diverse functions in mammalian cells. In crustacean, very limited studies on HMGB proteins have been documented. To investigate the role of high mobility group box (HMGB) proteins in innate immune system ofP. trituberculatus, the HMGB homologue cDNA fromP. trituberculatus(namedPtHMGBa) was first cloned by using the technology of rapid amplification of cDNA ends (RACE) in our study. The full-length cDNA ofPtHMGBawas 1030 bp in length, which includes an open reading frame (ORF) of 681 bp, a 255 bp 3′ untranslated region and a 94 bp 5′ untranslated region. The ORF encoded a polypeptide of 227 amino acids with a predicted molecular weight of 25.82 kD. The polypeptide contained two HMG boxes domain and a C-terminal acidic tail composed of 24 rich Asp/Glu residues. The BLAST analysis showed that HMGB shared the highest homology withLitopenaeus vannameiHMCBa. The expression ofPtHMGBawas mainly distributed in the haemocytes and hepatopancreas. A weak expression was detected in the eyestalk. Quantitative Real-time PCR analysis showed thatPtHMGBatranscripts up-regulated significantly in haemocytes at 6h postV. Parahemolyticusinflection and up-regulated significantly in hepatopancreas at 48h post infection. Meanwhile,PtHMGBatranscripts significantly up-regulated in haemocytes at 12h post WSSV inflection, and the same result was observed in hepatopancreas. Our results suggested thatPtHMGBamay play important roles in innate immunity of the crab, and would provide useful information for the research of immune regulation inP. trituberculatusand other crustaceans.

Portunus trituberculatus; HMGBa; Gene cloning; Innate immune; Expression analysis

S917

A

1000-3207(2017)06-1193-07

2016-12-12;

2017-04-12

泰山领军人才工程高效生态农业创新类计划(LJNY2015002); 国家自然科学基金面上项目(41506186); 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室开放课题(2016LMFS-A12)资助 [Supported by the Project of Taishan Scholars Leading Talent(LJNY2015002); the National Natural Science Foundation of China (41506186); Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, China (2016LMFS-A12)]

张杰(1991—), 男, 山东菏泽人; 硕士研究生; 主要从事三疣梭子蟹遗传育种研究。E-mail: Wfire1991@163.com

刘萍, 研究员, 硕士研究生导师; E-mail: liuping@ysfri.ac.cn